T7噬菌體尾蛋白P11的表達(dá)、純化及鑒定

趙翠嬌，寧保安，范獻(xiàn)軍，李桂敏，高志賢1，#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所 天津300050

T7噬菌體尾蛋白P11的表達(dá)、純化及鑒定

趙翠嬌1)，寧保安2)，范獻(xiàn)軍2)，李桂敏2)，高志賢1，2)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所 天津300050

#通訊作者，男，1966年5月生，博士，研究員，研究方向：食品安全，E-mail：gaozhx@163.com

T7噬菌體；P11蛋白；多克隆抗體

目的：表達(dá)、純化T7噬菌體尾蛋白P11并進(jìn)行鑒定。方法PCR擴(kuò)增T7噬菌體尾蛋白P11基因片段，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接表達(dá)載體pTIG-TRX，重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化目的蛋白，SDS-PAGE分析P11蛋白的相對分子質(zhì)量大小，并多次免疫新西蘭大白兔制備其多克隆抗體，Western blot鑒定蛋白活性。結(jié)果PCR擴(kuò)增P11基因后，成功誘導(dǎo)表達(dá)了含6×His標(biāo)簽的P11蛋白，SDS-PAGE顯示所表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量約為25 000，通過多次免疫獲得了抗P11的多克隆抗體并對其純化；制備的多克隆抗體能夠識別T7噬菌體和P11蛋白，具有較高特異性。結(jié)論成功表達(dá)了P11蛋白并制備了其多克隆抗體，為T7噬菌體展示系統(tǒng)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

T7噬菌體展示系統(tǒng)具有操作簡便、復(fù)制周期短、容易培養(yǎng)、生長迅速、系統(tǒng)穩(wěn)定、不需要分泌到周質(zhì)或膜外而直接展示的優(yōu)點，因此，T7噬菌體展示已發(fā)展為一種常見的展示系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于篩選基因工程抗體[1-3]。T7噬菌體衣殼蛋白主要包括頭蛋白P10A、P10B,頸圈蛋白P8，尾蛋白P11、P12和尾絲蛋白P17[4-5]。P11蛋白位于T7噬菌體的尾部。將制備的抗P11蛋白多克隆抗體應(yīng)用于噬菌體ELISA篩查，可使得融合于P10的蛋白或多肽更加有效地展示。為了進(jìn)一步開展T7噬菌體展示基因工程抗體的研究，作者采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)P11蛋白并制備出高效價的多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1主要試劑與實驗動物模板T7 Select 10-3b、表達(dá)載體pTIG-TRX、克隆菌株E.coliDH5α、表達(dá)菌株BL21(DE3)由)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室實驗室保存。質(zhì)粒pMD18-T購自大連TaKaRa公司。T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ購自Fermentas公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自美國Omega公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。清潔級健康新西蘭大白兔由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2重組克隆載體pMD18-T-P11的構(gòu)建P11蛋白基因片段的特異性上游引物為5’-GCGGAAT TCTAAATGCGCTCATACGATATGAAC-3’，下游引物為5’-GCCCTCGAGGCGAGTCAGTAGACCAG-3’，以T7 Select 10-3b為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系共20 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物并回收。回收后的目的基因片段末端加A后與克隆載體pMD18-T連接，而后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入氯化鈣法制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)，并接種到含有氨芐青霉素(0.1 g/L)的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃溫箱培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素(0.1 g/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，分別進(jìn)行菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定陽性克隆子，雙陽性克隆子送往北京Invitrogen公司測序。

1.3重組pTIG-TRX-P11表達(dá)載體的構(gòu)建選擇測序結(jié)果正確的菌株提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切出目的基因，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物并回收，回收后的目的基因與經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的表達(dá)載體pTIG-TRX連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的BL21(DE3)感受態(tài)，并接種到含有氨芐青霉素(0.1 g/L)的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃溫箱培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素(0.1 g/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，分別進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定陽性克隆子。

1.4重組P11蛋白的表達(dá)及純化陽性表達(dá)菌株過夜活化后以體積比1:100接種于含0.1 g/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h至A600 nm約為0.6，加入異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.001 mol/L，30 ℃振蕩培養(yǎng)5 h后收集菌體。用緩沖液A(0.02 mol/L PBS緩沖液，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4)重懸菌體，超聲破碎后離心收集上清并用3倍A液稀釋，加載到A液預(yù)平衡的Ni親和柱，上樣完畢后用A液平衡，用含0.02 mmol/L咪唑的A液洗脫雜蛋白，再分別用含0.05、0.10 mmol/L咪唑的A液洗脫目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。純化得到的P11蛋白經(jīng)HitrapTMDesalting柱去除咪唑，-20 ℃保存。

1.5動物免疫取健康雌性新西蘭大白兔3只，體重2.5 kg左右，免疫前1周于耳緣靜脈采血留作陰性血清。第一次基礎(chǔ)免疫取0.5 mg純化后的P11蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，于家兔背部四點注射，每點注射1 mL，以后每隔2個星期進(jìn)行1次基礎(chǔ)免疫，劑量加倍且用弗氏不完全佐劑乳化，從第3次免疫開始，每次免疫后1周于家兔耳緣靜脈采血，用間接ELISA測定血清效價情況。當(dāng)效價不再上升，進(jìn)行心臟取血，采血前3 d進(jìn)行一次不加佐劑的翻倍劑量加強免疫。

1.6多克隆抗體的純化及鑒定取抗血清用醋酸鹽緩沖液(0.06 mol/L，pH 4.0)稀釋4倍并調(diào)節(jié)pH至4.5，緩慢滴加辛酸[6]，4 ℃攪拌0.5 h后靜置2 h，4 ℃離心20 min(10 000 r/min)收集上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后加入PBS(0.1 mol/L)并調(diào)節(jié)pH至7.4，于冰水浴中邊攪拌邊緩慢加入等體積的飽和硫酸銨(pH 7.4)，使其成45%的飽和度，繼續(xù)攪拌0.5 h而后靜置2 h，4 ℃離心20 min(10 000 r/min)，沉淀溶于PBS，先用雙蒸水透析1 h，再用PBS(0.01 mol/L)透析12 h，4 ℃離心10 min，上清即為純化后所得多抗。抗體純化效果通過SDS-PAGE進(jìn)行測定，并根據(jù)其結(jié)果對加入的辛酸量進(jìn)行調(diào)整，純化得到的多克隆抗體的濃度通過BCA蛋白定量進(jìn)行測定。采用Western blot方法鑒定多克隆抗體活性。純化后的P11蛋白進(jìn)行120 g/L SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉過夜封閉，純化后多克隆抗體作為一抗(1:10 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，羊抗兔IgG作為二抗(1:2 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，ECL顯色試劑進(jìn)行顯色，壓膠片顯影。

2 結(jié)果

2.1P11蛋白基因片段的擴(kuò)增及重組克隆載體的鑒定經(jīng)鑒定，pMD18-T-P11構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 重組克隆載體pMD18-T-P11的酶切鑒定

M：Marker；1：雙酶切后的pMD18-T-P11；2：pMD18-T-P11。

2.2重組表達(dá)載體的鑒定菌落PCR和雙酶切鑒定陽性克隆子結(jié)果見圖2。

2.3重組P11蛋白的表達(dá)、純化SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，陽性菌株經(jīng)IPTG誘、導(dǎo)純化后，其細(xì)菌裂解液在約25 000出現(xiàn)高純度的蛋白條帶，與預(yù)期蛋白相對分子質(zhì)量相符，見圖3。

2.4多克隆抗體的純化及鑒定見圖4、5。經(jīng)條件優(yōu)化，純化出的多克隆抗體條帶清晰(圖4)，且經(jīng)ELISA鑒定其結(jié)合活性沒有受到影響。Western blot結(jié)果顯示：在相對分子質(zhì)量為25 000處T7噬菌體蛋白和6×His-P11蛋白有一條明顯的條帶，而空質(zhì)粒即pTIG-TRX菌株誘導(dǎo)蛋白則無此反應(yīng)(圖5)。

圖2 重組克隆載體pTIG-TRX-P11的酶切鑒定

M：Marker；1：雙酶切后的PTIG-TRX-P11；2：未酶切的PTIG-TRX-P11。

圖3 重組P11蛋白的純化

M：Marker；1～3：含0.02 mol/L咪唑的A液洗脫所得樣品；4～6：含0.05 mol/L咪唑的A液洗脫所得樣品；7、8：含0.1 mol/L咪唑的A液洗脫所得樣品；9、10：含0.5 mol/L咪唑的A液洗脫所得樣品。

圖4 抗P11蛋白多克隆抗體的純化

圖5 純化后多克隆抗體的Western blot鑒定

1：含空質(zhì)粒即pTIG-TRX的菌株誘導(dǎo)表達(dá)破碎后上清；2：P11蛋白；3：T7噬菌體。

3 討論

T7噬菌體展示系統(tǒng)能夠較完好地保持所展示蛋白的構(gòu)象，所篩選出的結(jié)合蛋白與其自然狀態(tài)較為接近[7]，與M13噬菌體系統(tǒng)所展示的蛋白相比，具有更好的多樣性，因此T7噬菌體展示系統(tǒng)在一定程度上彌補了絲狀噬菌體的不足[8]，近幾年在抗體篩選中應(yīng)用越來越廣泛。

為了開展T7噬菌體展示篩選基因工程抗體的研究，一種高質(zhì)量純化的P11蛋白和高效的抗體對于后續(xù)的ELISA篩查是必不可少的。為了促進(jìn)P11蛋白的高效表達(dá)，該實驗構(gòu)建了原核表達(dá)載體pTIG-TRX，此表達(dá)載體是由pET-22b改造而來，即在pET-22b內(nèi)部插入一段TRX的基因序列，使其能夠與目的基因進(jìn)行共表達(dá)。TRX即硫氧還蛋白，它是一種相對分子質(zhì)量為12 000的氧化還原蛋白，普遍存在于生物體內(nèi)，其作為原核生物的組成蛋白，雖不屬于分子伴侶的范疇，但具有與分子伴侶類似的功能，從而促進(jìn)包涵體的可溶表達(dá)[9]。

該研究構(gòu)建了6×His標(biāo)記的T7噬菌體尾蛋白P11原核表達(dá)載體PTIG-TRX-P11，鑒定其序列正確后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。利用6×His標(biāo)簽和鎳離子特異性螯合的特性純化，得到高純度的目的蛋白。以純化的P11蛋白為免疫原免疫新西蘭大白兔成功獲得了抗P11蛋白的多克隆抗體，為后續(xù)的T7噬菌體展示篩選基因工程抗體奠定了基礎(chǔ)。

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(2013-10-29收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Expression，purification and identification of T7 bacteriophage tail protein P11

ZHAOCuijiao1),NINGBao'an2)，F(xiàn)ANXianjun2),LIGuimin2),GAOZhixian1，2)1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

2)InstituteofHealth&EnvironmentMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Tianjin300050

T7 bacteriophage;P11 protein;polycolonal antibody

Aim: To express,purify and identify capsid tail protein P11 of T7 bacteriophage. Methods: Gene of protein P11 was amplified by PCR , digested with restriction endonucleaseEcoRⅠandXhoⅠand then inserted into the expression vector pTIG-TRX.The recombinant vector was transformed toE.coliBL21(DE3).After IPTG induction,the recombinant protein was purified by metal chelate chromatography.Its molecular weight was identified by SDS-PAGE and its activity was analysed by Western blot.The recombinant protein P11 was used to immune rabbit. Finally,the rabbit polycolonal antibody against protein P11 were obtained. Results: Gene of protein P11 was amplified by PCR.The recombinant protein P11 with 6×His tag has been successfully expressed after induction. SDS-PAGE analysis suggested that the molecular weight of the expressed protein was approximately 25 000. Western blot analysis suggested that the polycolonal antibodidy could recognize T7 phage and P11.Conclusion: We have purified P11 fusion protein and prepared the rabbit polycolonal antibody against protein P11 successfully,which lays foundation for the application of T7 phage display.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.017

R392.11