煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞環氧化酶-2 mRNA表達的影響*

楊維超，逯 洋,李 娟，晉樂飛,劉文佳，燕 貞，吳衛東

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州 450001 2)新鄉醫學院公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學教研室 新鄉 453003

煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞環氧化酶-2mRNA表達的影響*

楊維超1)，逯 洋1),李 娟1)，晉樂飛1),劉文佳1)，燕 貞1)，吳衛東2)#

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州 450001 2)新鄉醫學院公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學教研室 新鄉 453003

#通訊作者，男，1963年10月生，博士，教授，研究方向：分子毒理學，E-mail:xxmu2013@gmail.com

煤焦瀝青煙提取物；人支氣管上皮細胞；環氧化酶-2

目的：探討煤焦瀝青煙提取物(CTPE)對人支氣管上皮細胞環氧化酶-2(COX-2) mRNA表達的影響。方法應用RT-PCR方法測定不同質量濃度(2、4、8 mg/L)CTPE作用不同時間(2、4、8 h)對人支氣管上皮BEAS-2B細胞COX-2 mRNA表達水平影響。使用放線菌素(Act)D(1 mg/L)作用于BEAS-2B細胞，觀察其對2 mg/L CTPE作用30 min后的BEAS-2B細胞COX-2基因轉錄的影響。利用ZnSO4溶液刺激BEAS-2B細胞COX-2 mRNA表達，去除ZnSO4后，加入1 mg/L的Act D 30 min，檢測CTPE 作用不同時間點(0、2、4 h)的COX-2 mRNA表達的變化。結果2、4、8 mg/L CTPE刺激均可以使BEAS-2B細胞COX-2 mRNA表達水平升高(F組間=71.750,F時間=93.120,F交互=17.300，P<0.001), 2 mg/L是最佳劑量。用Act D(1 mg/L)預處理細胞30 min，可降低CTPE對COX-2 mRNA表達的誘導作用(FAct D=174.203,FCTPE=260.312,F交互=188.521，P<0.001)。使用ZnSO4刺激，然后使用Act D終止COX-2 mRNA合成后，不同時間點，CTPE組和對照組COX-2 mRNA的表達差異有統計學意義(F組間=365.700,F時間= 37.780,F交互=6.240，P<0.001)。結論CTPE可以通過轉錄水平和轉錄后水平誘導人支氣管上皮細胞COX-2 mRNA的表達。

煤焦瀝青是煤炭煉焦過程中產生的副產品,具有致癌性，可以誘發肺癌。肺癌是最為常見的惡性腫瘤之一，細胞中環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的過度表達與肺癌的發生密切相關。COX-2是誘導型酶，當細胞受到細胞因子、化學致癌物、內毒素等刺激作用后開始表達。研究[1-4]顯示COX-2是促癌的一種關鍵因子。作者以人支氣管上皮BEAS-2B細胞作為研究對象，測定煤焦瀝青煙提取物(coal tar pitch extract，CTPE)對BEAS-2B細胞COX-2 mRNA表達影響。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑中溫煤焦瀝青(安陽鋼鐵公司煉焦車間提供，常溫保存)，CTPE溶液由課題組前期制備[5]，BEAS-2B細胞(購自美國ATCC公司)為猴空泡病毒40永生化正常人支氣管上皮細胞，DMSO(天津市化學試劑三廠)，EB(北京索萊寶生物科技有限公司)，硫酸鋅(ZnSO4,上海化學試劑廠總廠所屬上海試劑廠二廠)，溴酚藍、PBS粉劑(北京索萊寶生物科技有限公司)，尼康YS100顯微鏡(日本Nikon公司)，723可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，MX3000-RT-PCR儀(日本SANYO公司)，超凈工作臺(廣東康力醫藥有限公司)。

1.2分組與處理采用BEAS-2B細胞半數抑制濃度作為最大染毒濃度，根據前期課題組實驗結果[5]，實驗設置2、4、8 mg/L染毒組和溶劑對照組，染毒組采用對應濃度的CTPE溶液處理，溶劑對照組采用體積分數0.1% DMSO處理。每個劑量組設置3個復孔，分別作用2、4、8 h。

1.3COX-2mRNA表達的檢測采用RT-PCR方法。收集細胞，提取RNA，將RNA逆轉錄為cDNA。對逆轉錄的cDNA進行實時定量RT-PCR擴增。 反應體系為：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL,上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，與DEPC水混勻，終體積為25 μL。反應條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，循環40輪;最后72 ℃延伸10 min。β-actin作為內參，用比較閾值法[5]計算COX-2 mRNA相對表達水平。

1.4放線菌素(Act)D轉錄抑制實驗將BEAS-2B細胞接種于12孔培養板，設DMSO對照組和 CTPE組、Act D 對照組和CTPE組，每組3孔。細胞生長至對數生長期時，DMSO對照組和 CTPE組加入1 mg/L DMSO，Act D 對照組和CTPE組加入1 mg/L Act D， 作用30 min后，再分別向DMSO CTPE組和Act D CTPE組加入2 mg/L CTPE。作用4 h后收集細胞,用1 mL Trizol提取細胞 RNA。用RT-PCR法檢測COX-2 mRNA水平。

1.5CTPE對COX-2mRNA穩定性的影響采用COX-2 mRNA降解測定法。BEAS-2B細胞接種于12孔培養板上，培養至對數生長期，加入陽性刺激物(ZnSO4)作用BEAS-2B細胞12 h[6]，然后去除ZnSO4，各孔中加入1 mg/L Act D，溫育30 min之后將細胞分為對照組(DMSO)和CTPE (2 mg/L)刺激組。CTPE作用0、2、4 h后收集細胞，用Trizol提取細胞RNA，用RT-PCR法檢測各組細胞COX-2 mRNA的表達水平。

1.6統計學處理應用SPSS 17.0分析。Act D對BEAS-2B細胞COX-2 mRNA表達抑制的影響和CTPE對BEAS-2B細胞COX-2 mRNA表達的影響及mRNA穩定性的比較采用析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組BEAS-2B細胞COX-2mRNA表達的比較結果見表1。

表1 各組BEAS-2B細胞COX-2 mRNA表達的比較(n=3)

F組間=71.750,F時間=93.120,F交互=17.300，P均<0.001。

2.2ActD轉錄抑制實驗結果見表2。

2.3CTPE對COX-2mRNA穩定性的影響結果見表3。

表2 Act D轉錄抑制實驗

FAct D=174.203,FCTPE=260.312,F交互=188.521，P<0.001。

表3 不同時間兩組BEAS-2B細胞COX-2 mRNA的表達量(n=3)

F組間=365.700,F時間= 37.780,F交互=6.240，P均<0.001。

3 討論

目前關于COX-2基因表達影響各種疾病發生發展國內外的報道較多。Hida等[7]發現70%的肺惡性腺瘤組織中COX-2高表達。趙媛等[8]在原發性肝細胞癌組織中發現COX-2 蛋白高表達。Khuri等[9]應用原位雜交技術對160例1期非小細胞肺癌患者進行檢測，結果發現COX-2的過表達可導致早期患者生存率的下降。而目前煤焦瀝青是否可誘導永生化人支氣管上皮細胞COX-2表達的相關研究尚未見報道。

該研究結果顯示，隨著CTPE劑量升高，COX-2 mRNA表達量逐漸下降。分析原因，可能由于CTPE細胞毒性較大， 8 mg/L為其半數抑制濃度[5]，可能超出了細胞能夠承載的毒物濃度，所以COX-2 mRNA表達下降。而隨著時間的推移，COX-2 mRNA表達先升高后降低，提示COX-2 mRNA有可能會參與轉錄后調節，即表達升高后一段時間內被降解，這與Wu等[6]的研究結果一致。CTPE刺激可能提高了BEAS-2B細胞內COX-2 mRNA的轉錄活性。該研究中，染毒濃度2 mg/L、染毒時間為4 h時，CTPE對BEAS-2B細胞COX-2 mRNA表達的影響比較明顯，因此采用這一實驗條件，用轉錄抑制劑Act D預處理細胞30 min，觀察其對CTPE誘導COX-2 mRNA表達的影響。結果表明，Atc D可顯著抑制CTPE對BEAS-2B細胞COX-2的誘導作用，進而也提示轉錄調節機制參與了CTPE對BEAS-2B細胞COX-2表達的誘導作用。

由于mRNA的穩定作用是轉錄后調控中一種重要機制[10-14]，所以作者通過采用mRNA降解試驗觀察CTPE對COX-2 mRNA的穩定作用，從而證實CTPE是否在轉錄后層面上影響COX-2 mRNA 的表達。該研究結果表明CTPE能在轉錄后維持COX-2 mRNA高水平表達，其機制可能是CTPE能夠減緩COX-2 mRNA的降解速度，提升其穩定性。

綜上所述，CTPE可能在轉錄及轉錄后的水平誘導人支氣管上皮細胞COX-2 mRNA的表達增加，具體機制需進一步實驗驗證。

[1]李帥帥，孫軍. PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路在姜黃素抑制人肝癌細胞Cox-2表達中的作用 [J]. 解放軍醫學雜志，2014，39(1)：30

[2]李寶龍，何燦霞，王鳳前，等.萊菔硫烷對膀胱癌細胞增殖抑制作用 [J]. 中國公共衛生，2012，28(2)：189

[3]Chen JJ, Huang WC, Chen CC. Transcriptional regulation of cyclooxygenase-2 in response to proteasome inhibitors involves reactive oxygen species-mediated signaling pathway and recruitment of CCAAT/ enhancer-binding protein delta and CREB-binding protein [J]. Mol Biol Cell, 2005, 16 (12): 5579

[4]趙麗，劉林嶓.皮膚癌組織中環氧合酶-2和缺氧誘導因子-1α的表達及微血管密度測定 [J].鄭州大學學報：醫學版，2008，43(2):210

[5]李智濤,馮艷銘,王威,等. 煤焦瀝青煙提取物致人支氣管上皮細胞BEAS-2B染色體不穩定性研究 [J].工業衛生與職業病, 2011, 37(3):129

[6]Wu W，Silbajoris RA, Cao D,et al.Regulation of cyclooxygenase-2 expression by cAMP response element and mRNA stability in a human airway epithelial cell line exposed to zinc [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2008,231(2):260

[7]Hida T,Yatabe Y,Achiwa H, et al. Increased expression of cycl-ooxygenase 2 occurs frequently in human lung cancers, specif ically in adenocarcinomas[J].Cancer Res,1998，58(17): 3761

[8]趙媛，張連峰，劉蔚，等.原發性肝細胞癌組織中環氧化酶-2及E-鈣黏蛋白的表達[J].鄭州大學學報：醫學版，2011，46(4):581

[9]Khuri FR, Wu H, Lee JJ, et al. Cyclooxygenase-2 overexpression is a marker of poor prognosis in stage Ⅰ non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res ，2001，7 (4):861

[10]Novoa I,Gallego J,Ferreira PG,et al.Mitotic cell-cycle progression is regulated by CPEB1 and CPEB4-dependent translational control [J].Nat Cell Biol,2010,12(5):447

[11]White NM, Chow TF, Mejia-Guerrero S, et al. Three dysregulated miRNAs control kallikrein 10 expression and cell proliferation in ovarian cancer [J].Br J Cancer, 2010,102(8):1244

[12]Lee HH,Vo MT,Kim HJ,et al.Stability of the LAST2 tumor suppressor gene is regulated by tristetraprolin [J].J Biol Chem, 2010, 285(23):17329

[13]Inui M,Martello G,Piccolo S.MicroRNA control of signal transduction [J].Nat Rev Mol Cell Biol,2010,11(4):252

[14]余光創,秦宜德,伯曉晨,等. 依賴于5’端非編碼區高級結構的真核生物mRNA翻譯調控 [J].中國生物化學與分子生物學報, 2007,23(11):881

(2013-11-17收稿 責任編輯李沛寰)

Effect of coal tar pitch smoke extract on cyclooxygenase-2 mRNA expression in human bronchial epithelial cells

YANGWeichao1),LUYang1),LIJuan1),JINLefei1),LIUWenjia1),YANZhen1),WUWeidong2)

1)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

2)DepartmentofOccupationalHealthandEvironmentalHealth,SchoolofPublicHealth,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003

coal tar pitch extract; human bronchial epithelial cells; cyclooxygenase-2

Aim: To examine the effect of coal tar pitch smoke extract(CTPE) on COX-2 gene expression in human bronchial epithelial cells. Methods:The human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) was used as an in vitro model. CTPE induced COX-2 mRNA expression were measured by RT-PCR. Actinomycin D，a transcription inhibitor, was applied to test the effect of CTPE on COX-2 gene transcription. mRNA decay assay was used to observe the effect of CTPE on COX-2 mRNA stability at post transcriptional level. Results: CTPE stimulation increased COX-2 mRNA expression in BEAS-2B cells(Fgroup=71.750,Ftime=93.120,Finteraction=17.300，allP<0.001). Pretreatment of BEAS-2B cells with Actinomycin D (1 mg/L),for 30 min could significantly reduce the effect of CTPE on COX-2 mRNA expression (FAct D=174.203,FCTPE=260.312,Finteraction=188.521，P<0.001). Actinomycin D was used to terminate COX-2 mRNA synthesis elevated by zinc sulfate. At different time points (0, 2, 4 h) COX-2 mRNA levels were higher in CTPE group than those in control group(Fgroup=365.700,Ftime=37.780,Finteraction=6.240,allP<0.05). Conclusion: CTPE stimulation can significantly increase COX-2 mRNA expression levels in BEAS-2B cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.013

*國家自然科學基金資助項目 81001240

R995