鹽酸夫拉平度對人骨肉瘤細胞MG63細胞周期及凋亡的影響

李 潔,施佳辰,李嘯然,李月白#, 全碧波,宋 石,王義生

1)鄭州大學基礎醫學院生物化學教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學基礎醫學院 鄭州 450001 3)鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州 450052

鹽酸夫拉平度對人骨肉瘤細胞MG63細胞周期及凋亡的影響

李 潔1),施佳辰2),李嘯然1),李月白1)#, 全碧波1),宋 石1),王義生3)

1)鄭州大學基礎醫學院生物化學教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學基礎醫學院 鄭州 450001 3)鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州 450052

#通訊作者，女，1961年1月生，博士，教授，研究方向：腫瘤分子生物學,E-mail：liyuebai@zzu.edu.cn

鹽酸夫拉平度；MG63；凋亡；CDK

目的：觀察不同濃度鹽酸夫拉平度(FP)對人骨肉瘤MG63細胞增殖活力、細胞周期及細胞凋亡的影響。方法用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液常規培養MG63細胞，取對數生長期增殖旺盛細胞分為對照組和不同濃度FP干預組。MTT比色法測定不同濃度的FP對細胞增殖活性的影響；流式細胞術檢測不同濃度的FP干預24和48 h后細胞周期變化和凋亡情況；RT-PCR測定不同濃度FP干預后，細胞周期相關基因表達的變化；Western blot檢測細胞內CDK2蛋白表達變化。結果50～2 000 nmol/L FP可抑制MG63細胞增殖活性，且有時間和濃度依賴性(F時間=319.470，F濃度=616.988，P均<0.001)；不同濃度的FP分別干預MG63細胞不同時間后均可引起細胞G2期阻滯(F24 h=6.805，F48 h=12.000，P均<0.001)，凋亡率增加(P均<0.001)，且可明顯降低MG63細胞中CDK2、Survivin mRNA及CDK2蛋白的表達(FmRNA=415.517、15.068，F蛋白=50.405，P均<0.001)。結論FP可抑制人骨肉瘤MG63細胞增殖及周期相關蛋白的表達，同時使細胞G2/M期阻滯并誘導細胞凋亡。

骨肉瘤是一種原發惡性腫瘤，以青少年為主要發病人群，其具有很強的侵襲能力，發病迅猛，惡性程度高，病死率驚人[1]。惡性腫瘤強大的增殖能力導致其分化水平很低，同時，細胞周期蛋白依賴激酶(cyclin dependent kinase，CDK)-Cyclin蛋白復合物調節分化相關的關鍵基因，因此，以抑制CDK激酶活性為目標的靶向藥物將有效控制細胞增殖能力，提高分化水平，同時能夠誘導細胞凋亡[2-3]。CDK抑制劑夫拉平度(flavopiridol，FP)對多種CDK表達有抑制作用，因此，可產生明顯細胞周期阻滯作用，明顯抑制腫瘤[4]。有研究[5-6]報道，FP能夠明顯抑制EFTs細胞生長，同時，FP對耐藥肉瘤細胞具有同樣的作用。該研究選取具有典型腫瘤特征和良好代表性的MG63骨肉瘤細胞系為實驗對象，觀察不同濃度FP作用于MG63細胞后對細胞增殖活力以及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1試劑FP、MTT、DMSO(美國Sigma公司)，人骨肉瘤細胞株MG63(北京協和細胞資源中心)，胰蛋白酶(美國Gibco公司),胎牛血清、DEPC、PCR擴增試劑盒(加拿大Fermentas公司)，RPMI 1640培養液(北京索萊寶科技有限公司)，Annexin V-FITC試劑盒(南京凱基公司)，其余試劑均為國產分析純。

1.2人骨肉瘤細胞系MG63的培養使用含體積分數10%胎牛血清的RMPI 1640培養液，在細胞瓶內接種細胞后置入37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。取對數期、增殖旺盛細胞進行連續培養。

1.3細胞增殖活力的MTT法檢測取對數生長期的MG63細胞，調細胞密度為2×104mL-1，接種于96孔培養板，每孔200 μL。細胞貼壁之后，棄去培養液，然后加入含FP濃度依次為50、100、200、300、400、500和2 000 nmol/L的培養液培養細胞。對照組不加藥，并設置調零孔，每組設置6個復孔，分別培養24、48和72 h，之后每孔加入MTT，4 h之后棄去上清液，加入DMSO 150 μL，終止反應。以調零孔光密度值(OD)調零校準，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測各孔的OD值。生長抑制率=[1-(受試組OD值)/(對照組OD值)]×100%。

1.4不同濃度FP干預對MG63細胞周期的影響取對數增殖期細胞，制成2×10 mL-1單細胞懸液，接種于75 cm2培養瓶中，在37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度條件下培養，貼壁后，加入200和400 nmol/L FP的RPMI 1640培養液，培養24和48 h，每個時間點都設置無藥對照組。收集細胞，加入體積分數70%的冷乙醇固定，放于4 ℃冰箱過夜，次日用流式細胞儀對樣本進行細胞周期分析。每組均設3個平行樣本。

1.5不同濃度FP干預對MG63細胞凋亡的影響細胞培養、分組同1.4。取1×106個細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS，重復以上操作。之后加入500 μL的Binding Buffer，輕輕振蕩使細胞懸浮，后依次加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI 輕輕混勻，室溫避光反應15 min。隨即用流式細胞儀進行檢測。每組均設3個平行樣本。

1.6不同濃度FP干預對MG63細胞中CDK2和SurvivinmRNA表達的影響Trizol法提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說明進行操作。CDK2上游引物序列5’-CCGCCTGGACACTGAGACT-3’，下游引物序列5’-GTGGAGGACCCGATGGA-3’，擴增產物大小為270 bp；Survivin上游引物序列5’-CAAGGAC CACCGCATCTC-3’，下游引物序列5’-CCAAGGGT TAATTCTTCAAACTG-3’，擴增產物大小為255 bp。β-actin上游引物序列5’-CTGGGACGACATG GAGAAAA-3’，下游引物序列5’-AAGGAAGGCT GGAAGACTGC-3’，擴增產物大小為540 bp。PCR的擴增條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35次循環；72 ℃延伸10 min。取RT-PCR產物進行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，以目的基因與內參條帶灰度值的比值為mRNA相對表達量。每組均設3個平行樣本。

1.7不同濃度FP干預對MG63細胞中CDK2蛋白表達的影響用100、200和300 nmol/L的FP干預MG63細胞5和10 d，以不加FP培養的細胞作對照，收集各培養瓶中細胞，提取細胞總蛋白。蛋白樣品以SDS-PAGE分離，然后通過半干轉印跡法轉移至NC膜上。將NC膜放入盛有50 g/L脫脂牛奶的托盤中，封閉2 h。封閉后的NC膜用TBS-T漂洗液進行漂洗。然后加入1:200稀釋的一抗(TBS-T配制)，4 ℃孵育過夜。TBS-T漂洗膜3次，10 min/次；加入二抗(按照抗體說明書稀釋)，于室溫孵育1.5 h，TBS-T漂洗3次，10 min/次。用X光底片進行顯影和定影并觀察。每組均設3個平行樣本。

1.8統計學處理采用SPSS 18.0進行分析。應用析因設計的方差分析比較不同濃度FP培養不同時間后MG63細胞增殖抑制率、CDK2和Survivin mRNA及CDK2蛋白表達水平的變化，應用多元方差分析法比較不同濃度FP培養24和48 h后MG63細胞周期的變化，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較不同濃度FP培養24和48 h后MG63細胞凋亡的變化，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同濃度FP干預不同時間后MG63細胞增殖活力的變化見表1。在24～72 h細胞增殖抑制率隨時間增長而增加；相同時間點，細胞增殖抑制率隨著藥物濃度(200～500 nmol/L)的增加而增加。

表1 不同濃度FP培養不同時間后MG63細胞增殖抑制率的變化(n=3) %

F濃度=616.998，F時間=319.470，F交互=18.234，P均<0.001。

2.2不同濃度FP培養24和48h后MG63細胞周期的變化見表2。結果提示FP作用24和48 h均可引起MG63細胞周期于G2/M期阻滯，并且在一定濃度范圍內，藥物濃度與阻滯效應呈正比。

表2 不同濃度FP作用MG63細胞24和48 h對細胞周期分布的影響(n=3) %

多元方差分析顯示：F24 h=6.805，P=0.004；F48 h=12.000，P<0.001。

2.3不同濃度FP培養24和48h后MG63細胞凋亡的變化見表3。

表3 不同濃度FP培養24和48 h后MG63細胞凋亡的變化(n=3) %

*:與0 nmol/L組相比，P<0.05；#：與200 nmol/L組相比，P<0.05。

2.4不同濃度FP培養不同時間后MG63細胞中CDK2和SurvivinmRNA表達水平的變化見表4、5。

表4 不同濃度FP培養不同時間后MG63細胞中CDK2 mRNA表達水平的變化(n=3)

F濃度=3 289.631，F時間=204.705，F交互=415.517，P均<0.001。

表5 不同濃度FP培養不同時間后MG63細胞中Survivin mRNA表達水平的變化(n=3)

F濃度=719.683，F時間=160.228，F交互=15.068，P均<0.001。

2.5不同濃度FP培養不同時間后MG63細胞中CDK2蛋白水平的變化見圖1、表6。

圖1 不同濃度FP培養不同時間后MG63細胞中CDK2蛋白水平的變化

表6 不同濃度FP培養不同時間后MG63細胞中CDK2蛋白水平的變化(n=3)

F濃度=382.862，F時間=547.093，F交互=50.405，P均<0.001。

3 討論

骨肉瘤是一種原發性惡性骨腫瘤，其較強的侵襲能力并可發生早期轉移成為骨肉瘤致死的主要原因[7]。由于發病機制尚未明確，目前仍無有效的治療手段，所以骨肉瘤患者預后差。因此，闡明其發病機制并找到有效治療靶點刻不容緩。

根據目前的研究結果顯示，骨肉瘤遺傳學上涉及了多個染色體區帶發生缺失、增加和重排，并存在rb、p53、cMyc等多個基因參與的信號通路脫調控。其中Rb蛋白作為細胞周期調節的關鍵因子之一，可在低度磷酸化狀態時與轉錄因子E2F結合阻止細胞由G1期進入S期，而這一過程與CDKs有著微妙的關系。

FP是一種半合成黃酮類衍生物，最初由藥用植物提煉，已有研究發現，FP可在除骨肉瘤細胞外的多種腫瘤細胞(如乳癌細胞)中抑制CDKs(CDK1、CDK2、CDK3、CDK4等)的活性，使細胞阻滯于G1、G2期，并可以有效誘導多種體外培養的腫瘤細胞發生凋亡[8-9]。此外，FP還可通過影響細胞內其他關鍵基因，如cyclin B、VEGF、survivin、bcl-2、cyclin D、p21等的轉錄與表達，上調HIF-1、E2F1和P53等蛋白表達水平等途徑對細胞產生影響[10]。

該實驗研究顯示，在骨肉瘤細胞中，FP濃度在200～500 nmol/L范圍內時作用于MG63細胞可抑制細胞生長并誘導細胞發生凋亡，且抑制率和凋亡率隨濃度增大而升高，具有濃度、時間依賴性。作者用200和400 nmol/L的FP分別作用于MG63細胞24和48 h后均引起不同程度的G2期阻滯，并伴隨著CDK2表達量的下調。眾所周知，FP對于CDKs具有廣泛的抑制作用，因此推測骨肉瘤MG63細胞中的這一現象與CDK2的表達下調密切相關。此外，該研究根據FP能夠降低Survivin表達，推斷FP誘導MG63細胞凋亡可能與調控Survivin的表達有關，通過作用于凋亡信號通路下游，誘導細胞凋亡。

綜上所述，該實驗闡明了FP可通過抑制CDK2和Survivin的表達使人骨肉瘤MG63細胞發生周期阻滯和誘導其凋亡，研究結果為臨床骨肉瘤的治療提供了新的實驗依據，也對FP的抗腫瘤應用提供了可靠理論價值。

[1]趙意華,陳清漢,華海嬰,等.氯化鋰對人骨肉瘤細胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表達的影響[J].鄭州大學學報:醫學版,2012,47(4):502

[2]Carassou P,Meijer L,Le Moulec SA,et al.Cell cycle and molecular targets: CDK inhibition[J].Bull Cancer,2012,99(2):163

[3]Bernardi A,Frozza RL,Hoppe JB,et al.The antiproliferative effect of indomethacin-loaded lipid-core nanocapsules in glioma cells is mediated by cell cycle regulation, differentiation, and the inhibition of survival pathways[J].Int J Nanomedicine,2013,8:711

[4]Liu XR,Shi SH,Lam F,et al.CDKI-71, a novel CDK9 inhibitor, is preferentially cytotoxic to cancer cells compared to flavopiridol[J].Int J Cancer,2012,130(5):1216

[5]王孟昌,張斌.Flavopiridol誘導多發性骨髓瘤細胞凋亡的分子機制[J].西安交通大學學報:醫學版,2011,32(2):201

[6]Caracciolo V,Laurenti G,Romano G,et al.Flavopiridol induces phosphorylation of AKT in a human glioblastoma cell line, in contrast to siRNA-mediated silencing of Cdk9:implications for drug design and development[J].Cell Cycle,2012,11(6):1202

[7]劉志禮,尹慶水,舒勇,等.Aurora-B、Ki-67在骨肉瘤中的表達與遠處轉移的關系[J].解放軍醫學雜志,2011,36(11):1197

[8]Schmerwitz UK,Sass G,Khandoga AG,et al.Flavopiridol protects against inflammation by attenuating leukocyte-endothelial interaction via inhibition of cyclin-dependent kinase 9[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(2):280

[9]Mahoney E,Lucas DM,Gupta SV,et al.ER stress and autophagy: new discoveries in the mechanism of action and drug resistance of the cyclin-dependent kinase inhibitor flavopiridol[J].Blood,2012,120(6):1262

[10]Nelson DM,Joseph B,Hillion J,et al.Flavopiridol induces BCL-2 expression and represses oncogenic transcription factors in leukemic blasts from adults with refractory acute myeloid leukemia[J].Leuk Lymphoma,2011,52(10):1999

(2013-09-22收稿 責任編輯趙秋民)

Flavopiridol suppresses cell cycle and induces apoptosis in human osteosarcoma MG63 cell line

LIjie1),SHIJiachen2),LIXiaoran1),LIYuebai1),QUANBibo1),SONGShi1),WANGYisheng3)

1)DepartmentofBiochemistry，CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

2)CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001 3)DepartmentofOrthopedicSurgery，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

flavopiridol；MG63；apoptosis；CDK

Aim: To investigate the influence of flavopiridol(FP) on proliferation, cell cycle and cell apoptosis in human osteosarcoma MG63 cell lines. Methods: The cells were cultured with RPMI1640 medium containing 10% of fetal bovine serum as usual, and treated with different concentration FP. MTT assay was used to detect the influence of different dose FP treatment on cell proliferation. Flow cytometry (FCM) was used to determine the cycle distribution and apoptosis status of the cells which treated with various concentration FP for 24 and 48 h respectively.RT-PCR was used to test the mRNA expression of cell cycle related genes after the FP intervention.The protein expression of CDK2 in cells after FP treatment was detected by Western blot. Results: FP could inhibit the cell proliferation in the range of 50 to 2 000 nmol/L, the inhibition rate also increased with time at the range from 24 to 72 h(Fconcentration=616.988,Ftime=319.470，P<0.001). The different concentrations of FP that respectively acting on the MG63 cells for different times could arrested MG63 cells at G2phase obviously (F24 h=6.805，F48 h=12.000，P<0.001) and increased apoptosis rate(P<0.001), and could also decrease the mRNA level of CDK2 and Survivin obviously in MG63 cells and down-regulate the expression of CDK2 protein as well(FmRNA=415.517，15.068，Fprotein=50.405，P<0.001). Conclusion: The CDK inhibitor flavopiridol can inhibit the cell proliferation and the expression of cell cycle related protein in human osteosarcoma MG63 cell, and induce the cell G2/M phase arrest and the cell apoptosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.020

R73-3