羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對NIH3T3細胞增殖、骨化分化的影響*

陳乃玲，穆 玉，李明珠,孫竹梅，徐寶珍

1)河北聯合大學口腔醫學院口腔中心實驗室 唐山 063000 2)河北聯合大學冀唐學院醫學實驗中心 唐山 063000 3)廈門市口腔醫院牙體牙髓科 廈門361000 4)河北聯合大學護理與康復學院 唐山 063000 5)河北聯合大學附屬醫院放療科 唐山 063000

羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對NIH3T3細胞增殖、骨化分化的影響*

陳乃玲1)△，穆 玉2)，李明珠3),孫竹梅4)，徐寶珍5)

1)河北聯合大學口腔醫學院口腔中心實驗室 唐山 063000 2)河北聯合大學冀唐學院醫學實驗中心 唐山 063000 3)廈門市口腔醫院牙體牙髓科 廈門361000 4)河北聯合大學護理與康復學院 唐山 063000 5)河北聯合大學附屬醫院放療科 唐山 063000

△女，1964年10月生，大專，實驗師，研究方向：口腔基礎和臨床教學，E-mail：chennailing158@126.com

羧甲基殼聚糖；溫敏性水凝膠；NIH3T3細胞；細胞增殖；細胞分化

目的：探討羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對NIH3T3細胞增殖、骨化分化的影響。方法采用MTT法和ALP法檢測20、100、150、200、500 g/L的羧甲基殼聚糖溫敏凝膠浸提液對體外培養NIH3T3細胞24、48和72 h后細胞增殖、骨化分化的影響。結果2種測定方法均顯示培養24、48和72 h后各實驗組細胞的OD值高于對照組(增殖：F組別=113.961，F時間=429.535，F交互=7.304，P均<0.001；骨化分化：F組別=57.043，F時間=3 177.618，F交互=12.827，P均<0.001)，其中150 g/L羧甲基殼聚糖溫敏凝膠浸提液對細胞的促進增殖和骨化分化效果最佳。結論羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對NIH3T3細胞的增殖及骨化分化均具有一定的促進作用。

隨著牙周病發病率逐年升高，牙周病的治療成為口腔臨床治療中的重要部分，其治療的最終目標是獲得牙周組織再生。近年來對羧甲基殼聚糖的研究日趨成熟，但是其能否促進牙周膜成纖維細胞的附著和增殖，尤其是促進其在重度牙周炎患牙病變牙根面上的附著和增殖及向成骨方面分化，目前還沒有明確的實驗證據。作者采用MTT法觀察羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對NIH3T3細胞增殖的影響，并通過測定細胞堿性磷酸酶(ALP)活力變化(其可反映其對細胞骨向分化能力的影響)，了解羧甲基殼聚糖溫敏凝膠用于牙周組織再生的可行性。

1 材料與方法

1.1細胞株、主要儀器和設備小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3(天津賽爾生物技術有限公司)，DMEM細胞培養基(高糖型)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(天津血液研究所)，ALP試劑盒(上海達豪生物科技有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)；CO2飽和濕度細胞培養箱(3336S/N307152-548，Forma Sicentific)，倒置顯微鏡(DIAPHOT-TMID，Nikon公司)，高速低溫離心機(德國Sigma公司)；NovapathTM全自動酶標儀(RC-232C，日本BIO-RAD公司)。

1.2NIH3T3細胞增殖的MTT法測定復蘇NIH3T3細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下見細胞縮小變圓脫落后，加入含體積分數10% FBS的完全培養基終止消化，10 000 r/min離心5 min后棄上清，加入含體積分數10% FBS的完全培養基，吹打混勻后以1×105mL-1的密度接種于3塊96孔培養板中，每塊板隨機分為5個實驗組和1個對照組，每組選用6個孔，每孔100 μL，在37 ℃、體積分數5% CO2孵箱中培養24 h。貼壁良好后，棄凈孔內液體，無血清DMEM洗滌3次。實驗組各孔分別加入浸提液(課題組在前期試驗中用羧甲基殼聚糖與β-甘油磷酸鈉互配，制備出在室溫下液體、在37 ℃發生凝膠化的羧甲基殼聚糖溫敏凝膠[1]，將制備好的羧甲基殼聚糖溫敏凝膠用含體積分數10% FBS的DMEM完全培養基配制成終質量濃度分別為20、100、150、200、500 g/L的羧甲基殼聚糖溫敏凝膠浸提液200 μL)，對照組只加含體積分數10% FBS的DMEM完全培養基進行培養，再放入37 ℃、體積分數5% CO2孵箱中培養，孔板周圍剩余孔內加入PBS緩沖液。在培養24、48和72 h后各取出一塊96孔板，避光條件下每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續培養4 h后吸去孔內培養液，再將每孔內加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長下測光密度(OD)值。

1.3NIH3T3細胞ALP活性測定細胞分組及培養同1.2。分別于24、48和72 h后各取出一塊培養板，棄孔內液體，用無血清DMEM洗滌后吸棄培養液，加入100 μL Triton X-100，置4 ℃冰箱過夜。倒置顯微鏡下觀察已無完整細胞結構后，振蕩混勻，取上述各孔液體各50 μL，空白對照選用50 μL雙蒸水，轉入另一96孔板，按ALP試劑盒說明依次按比例加入緩沖液、基質液，37 ℃水浴15 min，顯色劑顯色，在酶聯儀上于405 nm波長下測OD值。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用6×3析因設計的方差分析比較各組細胞培養不同時間后細胞增殖及細胞ALP活性的變化，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組細胞培養不同時間后細胞增殖的變化NIH3T3細胞復蘇后，倒置顯微鏡下可見細胞形態為典型的長梭形或不規則三角形，胞體較大，可見細胞突，細胞核亦較大較明顯，細胞均勻貼壁生長于瓶底。各組細胞培養不同時間后細胞增殖的變化見表1。

表1 各組細胞培養不同時間后細胞增殖的變化(n=6)

F組別=113.961，F時間=429.535，F交互=7.304，P均<0.001。

2.2各組細胞培養不同時間后細胞ALP活性測定結果見表2。

表2 各組細胞培養不同時間后細胞ALP活性測定結果(n=6)

F組別=57.043，F時間=3 177.618，F交互=12.827，P均<0.001。

3 討論

羧甲基殼聚糖是殼聚糖羧甲基化后的新型衍生物，除了具有良好的生物相容性和生物可降解性外，還有廣譜抗菌、抗感染和很強的凝血作用，具有促進傷口愈合、消炎止痛、增強免疫等多種生理活性作用，也有促進成骨細胞分化的作用[2-5]。莊昭霞等[6]將殼聚糖與羧甲基殼聚糖調制成復合膜，配制浸提液后證明其對牙周膜細胞具有良好促進增殖和分化的作用；另有學者[7]在對NIH3T3細胞和牙周膜成纖維細胞的試驗中發現，羧甲基殼聚糖可有效促進成纖維細胞的增殖和向成骨方向分化。但其能否促進牙周組織細胞在重度牙周炎患牙的病變牙根面上附著和增殖，從而促進牙周組織再生，需要進一步實驗證實。

溫敏凝膠具有臨界相轉變溫度，能因環境溫度的改變而發生可逆的膨脹、收縮，從而來控制藥物的釋放，成為近年來研究的新熱點[8]。目前，對溫敏性殼聚糖凝膠的研究較多，有關羧甲基殼聚糖溫敏性水凝膠的研究近年來報道甚少。課題組在前期試驗中用羧甲基殼聚糖與β-甘油磷酸鈉互配，制備出在室溫下液體、在37 ℃發生凝膠化的羧甲基殼聚糖溫敏凝膠。研究[9]已證實羧甲基殼聚糖溫敏凝膠具有良好的組織相容性，羧甲基殼聚糖溫敏凝膠除了擁有羧甲基殼聚糖的生物學優點之外，還因為溫敏凝膠系統具有溫度轉變性，可以通過注射的方式將其放置于需要的部位，載藥凝膠可以緩慢持續地釋放藥物,長時間與作用部位發生緊密接觸，提高藥物的生物利用度，減少給藥次數，增加藥物療效[10]。

該實驗通過觀察羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對NIH3T3細胞增殖、分化能力的影響，肯定了羧甲基殼聚糖溫敏凝膠的生物學作用，提示羧甲基殼聚糖溫敏凝膠在牙周組織再生領域具有遠大的應用前景，為牙周組織再生的研究提供充分而有利的依據，并指導臨床治療。但該研究也存在一定的不足，僅僅體外觀察了羧甲基殼聚糖溫敏凝膠作用24、48、72 h時的細胞增殖、分化情況，延長作用時間后是否依然能促進細胞增殖則有待于進一步實驗研究。

[1]彭偉,穆玉.羧甲基殼聚糖溫敏凝膠的制備及其毒性實驗[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,14(51):9591

[2]蔣挺大.甲殼素[M].北京:化學工業出版社,2003:301

[3]潘仕榮,陳浩凡,莫家聰,等.羧甲基殼聚糖用作防止術后粘連的研究[J].中國生物醫學工程學報,2006,25(3):277

[4]吳奕光,韋少慧,鄭宗坤,等.低取代6-0-羧甲基殼聚糖結構及其抗菌和促進皮膚創面愈合的研究[J].中國生物醫學工程學報,2006,25(5):613

[5]張永軍,高繼紅,薛毅,等.羧甲基殼聚糖在阻生齒拔牙創中的應用研究[J].中國醫藥指南,2008,6(5):14

[6]莊昭霞,林志勇,曹金芳.殼聚糖-羧甲基殼聚糖膜的生物相容性研究[J].上?？谇会t學,2003,12(5):362

[7]李巖.甲殼素及衍生物對NIH3T3細胞和人牙周膜細胞增殖的影響[D].石家莊:河北醫科大學,2005.

[8]Rossi S,Marciello M,Bonferoni MC,et al.Thermally sensitive gels based on chitosan derivatives for the treatment of oral mucositis[J].Eur J Pharm Biopharm,2010,74(2):248

[9]穆玉,陳乃玲,彭偉,等.羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對小鼠L929細胞增殖的影響[J].天津醫藥,2012,40(4):363

[10]林友文,方圓圓,孟曉丹.殼聚糖凝膠的溫敏性及其藥物緩釋性能研究[J].福建醫科大學學報,2009,43(1):37

(2013-10-23收稿 責任編輯趙秋民)

Effects of carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel on the proliferation and ossification differentiation of NIH3T3 cells

CHENNailing1),MUYu2),LIMingzhu3)，SUNZhumei4),XUBaozhen5)

1)CenterLaboratoryofStomatology,CollegeofStomatology,HebeiUnitedUniversity，Tangshan063000 2)MedicalResearchCenter,JitangCollege，HebeiUnitedUniversity，Tangshan063000 3)DepartmentofEndodontics，XiamenStomatologicalHospital，Xiamen，361000 4)CollegeofNursingandRehabilitation,HebeiUnitedUniversity，Tangshan063000 5)DepartmentofRadiotherapy，AffiliatedHospital，HebeiUnitedUniversity，Tangshan063000

carboxymethyl chitosan；themosensitive hydrogel；NIH3T3 cell；proliferation；diferentiation

Aim: To explore the effects of carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel on NIH3T3 cell proliferation and ossification differentiation. Methods: MTT method and ALP method were used to test the effects of 20, 100, 150, 200, 500 g/L carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel leaching liquors on NIH3T3 cell proliferation and ossification differentiation which was cultured in vivo for 24, 48 and 72 h. Results: Both methods showed thatODvalues of various experimental groups cultured for 24, 48 and 72 h were higher than that of the control group (proliferation:Fgroup=113.961,Ftime=429.535,Finteraction=7.304,P<0.001; ossification differentiation:Fgroup=57.043,Ftime=3 177.618,Finteraction=12.827,P<0.001); 150 g/L carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel leaching liquor had the best cell proliferation and ossification differentiation effects. Conclusion: Carboxymethyl chitosan thermosensitive hydrogel can promote NIH3T3 cell proliferation and ossification differentiation.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.027

*唐山市科技計劃項目 13130276z

R781.3