3個不同地理日本沼蝦天然群體遺傳多樣性的SSR分析

夏建海，范武江，王曉清，馬 曉，戴振炎，王璐明

(1.湖南農業大學動物科技學院，中國 長沙 410128；2.上海市水產研究所，中國 上海 200433)

3個不同地理日本沼蝦天然群體遺傳多樣性的SSR分析

夏建海1，范武江2*，王曉清1*，馬 曉1，戴振炎1，王璐明1

(1.湖南農業大學動物科技學院，中國 長沙 410128；2.上海市水產研究所，中國 上海 200433)

利用11對微衛星引物對洞庭湖、鄱陽湖、龍感湖的日本沼蝦天然群體進行遺傳多樣性的分析，評價不同地理日本沼蝦天然群體的遺傳多樣性和遺傳分化水平．在3個日本沼蝦群體中共獲得90個等位基因，各位點平均等位基因為8.182個，各群體的平均等位基因數在(A)32～38之間，平均多態信息含量(PIC)介于0.590 7～0.643 0，平均期望雜合度He為0.657 7～0.705 5、平均觀測雜合度Ho為0.514 1～0.579 9．群體間各位點Shannon指數均大于1，Fis均為正值，群體間平均近交系數為19%，Fst值顯示整個群體分化程度較低，其中遺傳變異的5.38%存在于群體之間，94.62%存在于個體之間．結果表明：3個日本沼蝦天然群體的遺傳多樣性較高，分化程度較低，其中鄱陽湖群體遺傳多樣性最豐富，遺傳分化水平最低．

日本沼蝦；微衛星；遺傳多樣性；遺傳分化

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)俗稱青蝦、河蝦，隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)[1-2]．湖南洞庭湖、江西鄱陽湖、湖北龍感湖是我國日本沼蝦天然資源較豐富的分布區和產區[3-4]．近年來，日本沼蝦由于營養豐富、口味鮮美、市場價值較高而得到廣泛養殖[5-6]．國內外有關日本沼蝦遺傳多樣性的研究，已報道的有采用線粒體16SrRNA序列片段變異和COI方法分析長江和五大淡水湖天然日本沼蝦群體遺傳多樣性[7-8]，采用RAPD[9]和AFLP[10]方法分析長江、龍港湖、太湖等天然日本沼蝦群體遺傳多樣性，使用線粒體COI序列分析我國九大水系、五大淡水湖及長江中下游流域日本沼蝦種質資源遺傳多樣性和系統進化[11-12]，以及采用微衛星標記研究太湖、洪澤湖、錢塘江天然日本沼蝦遺傳多樣性[13-15]．本研究采用SSR標記技術分析我國洞庭湖、鄱陽湖、龍感湖日本沼蝦群體的遺傳多樣性，探討三大湖泊日本沼蝦群體的遺傳結構和群體分化水平，以期為保護我國天然日本沼蝦種質資源及合理開發利用提供更科學的理論依據．

1 材料與方法

1.1 樣本的采集及DNA提取

2011年12月分別對湖南洞庭湖(DT)、江西鄱陽湖(PY) 、湖北龍感湖(LG)3個天然日本沼蝦群體進行采樣，具體采樣地點如表1所示．每個群體采樣29尾,剪取尾部肌肉用無水乙醇固定后帶回實驗室，放入4 ℃冰箱保存備用．基因組DNA的提取參照目前通用的柱式肌肉試劑盒(天恩澤試劑公司)方法操作，并檢測其濃度和純度，-20 ℃保存備用．

表1 日本沼蝦樣本采集地

1.2 微衛星引物的篩選及擴增

從相關文獻和GenBank庫中搜索青蝦微衛星序列，設計了47對引物，委托上海生工生物工程技術服務公司合成．首先用2個樣本篩選引物，并摸索PCR條件．反應體系：PCR MagicMIX 7.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, DNA模板0.5 μL，ddH2O 6.0 μL．PCR反應條件：94 ℃變性4 min，94 ℃ 30 s,退火30 s,72 ℃延伸1 min，經過26個循環，72 ℃延伸10 min,4 ℃保存．各引物的退火溫度見表2．PCR產物經1%(質量分數，下同)的瓊脂糖電泳檢測合格后，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用pBR322DNA/MspI作為相對分子質量標準，銀染后拍照分析．

1.3 數據處理

參照Marker大小對所擴增條帶估算相對分子質量，確定其基因型，并利用GENEPOP1.32軟件進行數據分析，分別計算等位基因數、等位基因頻率、有效等位基因數、觀測雜合度、期望雜合度、Hardy-Weinberg遺傳偏離指數、遺傳分化，用PIC-CALC軟件對各微衛星位點的多態信息含量進行計算．

2 結果與分析

2.1 引物篩選與擴增圖譜

選取11對微衛星引物進行PCR擴增，在3個群體中均獲得較好的擴增結果，圖1為引物Mn11擴增圖譜．11對引物共獲得90個等位基因，各位點出現等位基因3～13個不等，平均獲得8.182個等位基因，其中Mn 24位點獲得等位基因最多為13個，其次Mn 5和Mn 37位點為11個，Mn3位點獲得位點最少為3個．

圖1 DT、LG、PY日本沼蝦天然群體Mn11位點的微衛星檢測圖譜Fig.1 Demonstration of microsatellite locus amplified by Mn11 primer pairs in three different wild macrobrachium nipponense populations

表2 日本沼蝦微衛星引物序列及退火溫度

2.2 各群體遺傳多樣性分析

11個微衛星位點在3個群體中的遺傳多樣性參數見表3，通過每個微衛星位點的基因頻率計算出每個位點在群體中的平均多態信息含量(PIC)介于0.454 7～0.750 4，其中Mn27位點所含多態信息含量最高為0.750 4，Mn3位點多態信息含量最低為0.454 7，其余基因位點PIC值均在0.5以上，這表明各位點均為較高多態位點，方可有效進行后續分析．3個群體在11個微衛星位點的遺傳多樣性參數見表4，其平均有效等位基因介于3.191 9～3.458 2，平均期望雜合度、觀測雜合度和平均多態信息含量鄱陽湖最高分別為0.705 5、0.579 9、0.643 0．這表明3個群體中鄱陽湖的遺傳多樣性最高．

表3 11個微衛星位點有效等位位點數、雜合度及多態信息含量

表4 3個群體在11個微衛星位點的遺傳多樣性

2.3 微衛星位點Hard-Weiberg平衡分析

經卡方檢驗各位點在群體中的Hard-Weiberg平衡檢驗P值(表5)，發現鄱陽湖、龍感湖均有4個位點顯著偏離Hard-Weiberg平衡，其中洞庭湖最多，有5個位點顯著偏離Hard-Weiberg平衡，1個發生平衡偏離．

表5 日本沼蝦3個天然群體11個群體位點的有效等位基因數、雜合度值及P檢驗值

注：*P<0.05，**P<0.01.

2.4 群體遺傳變異分析

表6顯示11個位點中Mn3的Shannon指數較低，說明其遺傳變異程度較低，其余位點的變異程度較高，3個群體遺傳變異程度由高到低依次為鄱陽湖、洞庭湖、龍感湖．表7中各位點的F-統計量參數顯示，Fis均為正值，群體間平均近交系數為19%，Fst值介于0.017 6～0.151 5之間，屬于中等分化(0.054,反映群體間的基因流通暢．

表6 3個日本沼蝦種群的11個微衛星座位的Shannon指數

表7 3個日本沼蝦種群15個微衛星座位的F-統計量

3 討論

3.1 3個地理日本沼蝦天然群體的遺傳多樣性

本研究利用篩選出的11對微衛星引物對洞庭湖、龍感湖和鄱陽湖3個日本沼蝦群體的遺傳多樣性分析表明，其多態信息含量PIC介于0.454 7～0.750 4之間．根據高度多態性信息含量衡量標準，PIC>0.5[16]，除Mn3位點處于中度多態位點，其余均屬于高度多態性位點．從龍感湖、洞庭湖、鄱陽湖實驗數據依次來看，平均等位基因數為32、35、38，平均多態信息含量(PIC)0.5907、0.6115、0.6430，平均期望雜合度(He)0.657 7、0.679 8、0.705 5，比洪澤湖日本沼蝦(He=0.698～0.804)[14]、錢塘江日本沼蝦(He=0.83～0.88)[15]和太湖日本沼蝦(He=0.893 7～0.934 4)[13]的平均期望雜合度低，與楊頻[17]等對鄱陽湖日本沼蝦群體遺傳多樣性分析的結果有較大差異，其主要原因是湖泊面積較大，采樣范圍和數量較少導致．研究表明洞庭湖、龍感湖和鄱陽湖3個日本沼蝦群體的遺傳多樣性較高，其中鄱陽湖遺傳多樣性最為豐富，龍感湖遺傳多樣性最低，與蔣速飛等[9]、馮建彬等[18]對我國各大湖泊日本沼蝦群體遺傳多樣性的結論相似．根據Shannon多樣性指數，鄱陽湖、洞庭湖，龍感湖的遺傳變異程度依次為1.316 8，1.262 3,1.210 1，進一步說明鄱陽湖群體的遺傳多樣性最為豐富，這可能與鄱陽湖域的水文環境變化大有密切的關系．

3.2 日本沼蝦群體內的Hardy-Weinberg平衡狀況

利用Hardy-Weinberg平衡定律對每個位點平衡狀態的分析結果(表4)表明，每個群體中均有4個位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，顯現雜合不足，說明這3個群體多數微衛星位點偏離Hardy-Weinberg平衡，據Hardy-Weinberg平衡基本條件，足夠大的群體交配隨機，未出現選擇、遷移、突變和遺傳漂變等現象[19]，偏離平衡的原因主要在于日本沼蝦自身的特點和生活習慣，并受其水域環境的影響，也反映了由于內陸湖泊長期與江湖阻隔以及生境條件的不同, 導致群體內遺傳分化較嚴重．另一個原因是長年受人們捕撈過度的影響導致群體內自交現象比較嚴重[13]，從而使得這3個群體日本沼蝦偏離Hardy-Weinberg平衡．因此，除了自然因素的制約，人為因素也會加快日本沼蝦天然遺傳資源的稀釋和衰退速度，進一步導致種質退化和優良性狀的喪失．

3.3 3個日本沼蝦群體間遺傳分化分析

Fst值和基因流是衡量群體間的遺傳分化程度的主要指標，本實驗得出各位點的F-統計量參數顯示，Fis均為正值，群體間平均近交系數為19%，Fst值介于0.017 6～0.151 5，屬于中等偏低分化(0.05

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(編輯 王 健)

Genetic Diversity in Three Different Natural Populations ofMacrobrachiumnipponenseRevealed by SSR Markers

XIAJian-hai1,FANWu-jiang2*,WANGXiao-qing1*,MAXiao1,DAIZhen-yan1,WANGLu-ming1

(1.College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2. Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai 200433, China)

To evaluate the genetic diversity and genetic differentiation of the different natural populations ofMacrobrachiumnipponense, 11 microsatellite locus were used to analyze the genetic diversity in three natural populations ofMacrobrachiumnipponenseDongting, Poyang and Longgan. The results showed that 11 microsatellite locus were highly polymorphic. A total of 90 alleles were detected, each loci had 8.182 alleles. In these natural populations the average number of allele (A ) ranged from 32 to 38, and the value of average polymorphism information content ( PIC ) was 0.590 7 to 0.643 0, the value of average expected heterozygosityHewas 0. 657 7 to 0.705 5, the value of average observed heterozygosityHoin three populations ranged from 0.514 1 to 0.579 9. Shannon indexes were greater than 1.Fiswere positive, average inbreeding coefficient of populations was 19%.FstValues show that the whole populational differentiation degree was lower. Most variation occurred within populations (94.62) among population (5.38). The results showed that the genetic diversity is richer in three natural populations ofMacrobrachiumnipponense, and Poyang is the most abundant in genetic diversity population and the lowest level of genetic differentiation.

Macrobrachiumnipponense; microsatellite; genetic diversity; genetic differentiation

2013-04-15

上海市農業委員會資助項目(滬農科推字(2011)第6-1號)

*

,E-mail：wangxiao8258@126.com； fanwujiang@126.com

S917

A

1000-2537(2014)04-0023-06