麻仁潤腸丸、大黃和大黃素對大鼠大腸神經系統影響的研究

婁秀輝 黃光明 王楠 萬欣 葛欣 李景瑞

便秘是一種影響人類健康和生活質量的常見疾病。據北京、西安、天津等地的調查發現便秘的發生率可達6.07%～9.18%[1]。便秘的發病原因目前尚不十分清楚，但其中大多數患者為功能性疾患。對功能性便秘的治療應遵循個體化治療的原則，對于中、重度的便秘，短期或長期的藥物治療是主要的治療手段。我國傳統的中藥對功能性便秘的治療有著得天獨厚的優勢，麻仁潤腸丸即是我國傳統復方中藥的一個代表。但是，關于麻仁潤腸丸的研究還停留在臨床經驗方面，對麻仁潤腸丸的作用機理還沒有系統的研究，還有很多問題需要解決。有鑒于此，我們對比研究麻仁潤腸丸、大黃和大黃素瀉下作用的效果和副作用，并對麻仁潤腸丸的作用機制作一初步的探討，希望我們的研究可以為麻仁潤腸丸的臨床應用尋找理論上的依據。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑：麻仁潤腸丸購自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，大黃粉由本院自制，大黃素和MTT均購自美國Sigma公司，CHAT一抗購自美國Santa Cruz公司，nNOS和β-Tubulin一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，熒光標記的二抗購自Invitrogen公司，其他使用的試劑均為分析純。

2.藥物配制與給藥：麻仁潤腸丸組：將麻仁潤腸丸溶于5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC)配制成640 mg/ml的混懸液，按照3200 mg/kg/d灌胃給藥；大黃組：大黃粉溶于5% CMC配制成160 mg/ml的混懸液，按照800 mg/kg/d灌胃給藥；大黃素組：將大黃素用5% CMC配制成8 mg/ml的混懸液，按照40 mg/kg/d灌胃給藥。正常對照組給予相當體積的5% CMC。麻仁潤腸丸、大黃以及大黃素的用量參考人體用量和其它參考文獻。

3.動物飼養與分組：清潔級SD大鼠192只，購于哈爾濱醫科大學附屬第三醫院動物中心，雌雄不拘，8到10周齡，體重170～200 g。分組采用隨機數字表的方法。96只大鼠隨機分為正常對照組、麻仁潤腸丸組、大黃組和大黃素組，用于檢測大鼠一般狀況、腸道傳輸功能，其中每組12只動物用于7 d時大腸運動頻率和幅度檢測、每組另12只動物用于一般狀況和28 d時大腸運動頻率和幅度檢測。另96只大鼠隨機分為正常對照組、麻仁潤腸丸組、大黃組和大黃素組，其中每組12只動物于7 d時檢測腸壁組織、腸道傳輸功能、腸壁腸肌叢內神經的變化情況，每組另12只動物于28 d檢測上述指標。

二、方法

1.檢測大鼠一般狀況：目測各組大鼠皮毛色澤、活動度及精神狀態等的變化；檢測各組大鼠在實驗開始前1 d和實驗開始后1 d、4 d、7 d、14 d、28 d大便顆粒數和大便總重量；測量各組大鼠體重在上述時間點的變化。

2.檢測大鼠大腸腸壁組織在光學顯微鏡下的情況：檢測正常對照、麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠在實驗7 d、28 d光鏡下黏膜層的厚度、絨毛高度、隱窩深度的改變；

腸道組織學觀察及評分：參照文獻[2]，各組動物在實驗7 d、28 d處死，分離結腸，自距肛門10 cm處沿長軸剖開結腸，冰生理鹽水反復沖洗腸腔，肉眼觀察大腸黏膜損傷程度，取腸組織一部分以40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后光學顯微鏡下觀察組織病理改變，并對大腸組織學損傷進行評分[3]：無明顯炎癥，腸壁黏膜組織和隱窩深度正常為0分；少量淋巴細胞浸潤(≤10%高倍視野)，腸壁并無結構的改變為1分；中量淋巴細胞浸潤(10%～25%高倍視野)，隱窩稍變深，腸壁增厚，但未透過黏膜層，無潰瘍形成為2分；明顯淋巴細胞浸潤(25%～50%高倍視野)，血管密度增加，隱窩變深，腸壁增厚，透過黏膜層：3分；大量淋巴細胞浸潤(≥50%高倍視野)，血管密度增加，隱窩變深并扭曲，腸壁全層增厚，可見潰瘍形成為4分。

3.檢測大鼠腸道運動功能的情況：(1)分別在實驗7 d、28 d做墨汁推進實驗[4]，比較正常對照、麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠腸道內墨汁推進距離的差異。(2)分別在實驗7 d、28 d檢測大鼠的結腸肌電活動[5]，比較正常對照、麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠結腸肌電活動的區別。

4.檢測大鼠腸壁腸肌叢內神經元的情況：Western Blot 法檢測正常對照、麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠在實驗7 d、28 d時腸肌叢內的CHAT和nNOS蛋白表達，比較各組的差異。

三、統計方法

數據均以Means±SE表示，每個實驗至少重復三次。組間單變量統計分析采用one-way ANOVA法；組間兩個單獨變量統計分析采用Tukeyposthoc檢測以及two-way ANOVA法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、大鼠一般狀況的檢測結果

麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠和對照組相比，在體重、大便總重和大便例數方面都有變化，麻仁組變化最輕(表1)。

二、大鼠大腸腸壁組織在光學顯微鏡下檢測結果

實驗7 d、28 d在光學顯微鏡下觀察大鼠大腸組織，其病理評分見表2。

三、大鼠腸道傳輸率的檢測結果

麻仁潤腸丸組大鼠于7 d、28 d腸道傳輸速率分別為77.1±4.6和75.4±4.2，均明顯快于正常對照組65.2±4.3和65.8±4.4(P<0.05)。大黃組大鼠于7 d腸道傳輸速率分別為78.3±4.8，也明顯快于正常對照組(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較無明顯變化；于28 d腸道傳輸速率分別為68.7±3.5，明顯快于正常對照組(P<0.05)，明顯慢于麻仁潤腸丸組(P<0.05)。大黃素組大鼠于7 d腸道傳輸速率分別為78.7±5.0，明顯快于正常對照組(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較無明顯變化；于28 d腸道傳輸速率分別為67.2±3.1，明顯快于正常對照組(P<0.05)，明顯慢于麻仁潤腸丸組(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠腸道傳輸速率(Means±SE)

表4 各組大鼠結腸慢波頻率與振幅(Means±SE)

四、大鼠的結腸慢波頻率與振幅的檢測結果

麻仁潤腸丸組大鼠于7 d、28 d的結腸慢波頻率與振幅分別為17.23±1.76與0.57±0.08、16.87±1.76與0.56±0.08，均明顯快于和高于正常對照組的11.76±1.89與0.45±0.10、11.38±1.87與0.44±0.11(P<0.05)。大黃組大鼠于7 d的結腸慢波頻率與振幅分別為18.01±1.65與0.58±0.08，明顯快于和高于正常對照組(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較無明顯變化；于28 d的結腸慢波頻率與振幅分別為13.54±1.85與0.52±0.08，明顯快于和高于正常對照組(P<0.05)，明顯慢于和低于麻仁潤腸丸組(P<0.05)。大黃素組大鼠于7 d的結腸慢波頻率與振幅分別為18.54±1.83與0.59±0.07，明顯快于和高于正常對照組(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦無明顯變化；于28 d的結腸慢波頻率與振幅分別為13.24±1.21與0.51±0.07，明顯快于和高于正常對照組(P<0.05)，明顯慢于和低于麻仁潤腸丸組(P<0.05，表4)。

五、大鼠腸壁腸肌叢內CHAT和nNOS蛋白表達量的變化

在于實驗7 d、28 d通過Western Blot法檢測四組大鼠腸肌叢內的CHAT和nNOS蛋白表達。

1.CHAT蛋白檢測結果顯示：麻仁潤腸丸組于7 d、28 d的CHAT蛋白含量分別是正常對照組的1.11、0.95倍，與正常對照組比較無明顯變化；大黃組于7 d、28 d的CHAT蛋白含量分別是正常對照組的1.73、0.72倍，與正常對照組比較均有明顯變化(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦均有明顯變化(P<0.05)；大黃素組于7 d、28 d的CHAT蛋白含量分別是正常對照組的2.24、0.61倍，與正常對照組比較均有明顯變化(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦均有明顯變化(P<0.05，圖1)。

注：C為正常對照組；M為麻仁潤腸丸組；R為大黃組；E為大黃素組，*代表與對照組比較P<0.05，#代表與麻仁潤腸丸組比較P<0.05

2.nNOS蛋白檢測結果顯示：麻仁潤腸丸組于7 d、28 d的nNOS蛋白含量分別是正常對照組的0.94、1.13倍，與正常對照組比較無明顯變化；大黃組于7 d、28 d的nNOS蛋白含量分別是正常對照組的0.83、1.75倍，與正常對照組比較均有明顯變化(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦均有明顯變化(P<0.05)；大黃素組于7 d、28 d的nNOS蛋白含量分別是正常對照組的0.64、2.32倍，與正常對照組比較均有明顯變化(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦均有明顯變化(P<0.05，圖2)。

注：(n=3，means±SE，*代表與對照組比較P<0.05，#代表與麻仁潤腸丸組比較P<0.05)

討 論

便秘是一種影響人類健康和生活質量的常見疾病。在發達國家便秘的發生率占人群的10%～15%左右。

瀉劑結腸是指長期大劑量服用刺激性瀉劑而致結腸神經系統(enteric nervous system,ENS)失調和相應功能紊亂，導致腸動力障礙，對瀉劑反應性明顯下降，使患者對瀉劑產生依賴的一種狀況，是慢傳輸性便秘(slow transit constipation,STC)的一種重要臨床類型[6]。

在本實驗中，我們首先觀察了各給藥組大鼠的一般狀況和腸壁組織病理狀況。結果顯示，麻仁潤腸丸長期給藥后瀉下作用可穩定保持、對腸壁組織影響較小，而大黃和大黃素組長期給藥后瀉下作用減弱、對腸壁組織影響較大，主要表現在大便顆粒數和大便總重量于實驗后期增多和增重的幅度明顯小于麻仁潤腸丸組；動物體重明顯減輕；腸壁組織病變情況明顯加重。說明長期給藥后麻仁潤腸丸的瀉下作用優于大黃、大黃素；對腸壁組織的損傷小于大黃和大黃素。

1943年，Heibrun[7]研究了27例長期服用瀉劑的便秘病人，發現結腸袋狀收縮消失、腸腔擴張，黏膜萎縮，黏膜下層有單核細胞浸潤和脂肪沉積，并首次提出了“瀉劑結腸”的觀點。近年的研究借助放射免疫分析、免疫組化等方法發現“瀉劑結腸”ENS的多種神經遞質含量或分布異常，其特征與STC結腸的變化相似，大鼠“瀉劑結腸”腸道傳輸減慢也符合STC的特點，說明接觸性瀉劑在STC的發生發展中有促進作用[8]。結腸的肌電活動有3種表現形式:(1)電控制活動(electrical control activity,ECA)，又稱慢波或基本電節律。(2)電振蕩活動(electrical oscillatory activity,EOA)。(3)電反應活動(electrical response activity,ERA)，又稱峰電位或動作電位。動作電位產生于慢波之上，與平滑肌收縮相一致，是推進性運動的主要動力。慢波是相對規律的一種周期性電活動，控制腸道收縮的節律，無論收縮與否始終存在[9]。有研究表明大劑量應用刺激性瀉劑可影響結腸慢波的產生和傳導。其頻率異常會導致腸道的推進性收縮頻率減慢或收縮不協調，其振幅降低會導致結腸收縮力下降，結果表現為結腸運動無力，腸道傳輸功能遲緩。

在本實驗中，我們于7 d、28 d檢測了大鼠腸道傳輸速率和結腸慢波頻率與振幅。結果顯示，麻仁潤腸丸長期給藥后對大鼠腸道傳輸速率和結腸慢波頻率與振幅影響可穩定保持，而大黃和大黃素組長期給藥后對大鼠腸道傳輸速率和結腸慢波頻率與振幅影響變化較大，主要表現在給藥后期大鼠的腸道傳輸速率明顯慢于麻仁潤腸丸組；大鼠結腸慢波頻率與振幅明顯慢于和低于麻仁潤腸丸組。說明長期給藥后麻仁潤腸丸對大鼠腸道傳輸速率和結腸慢波頻率與振幅的影響優于大黃和大黃素組。

胃腸運動由交感、副交感神經系統、腸神經系統和Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)組成的腸神經細胞網絡控制[10-12]。腸神經系統遞質多達數十種，其中興奮性遞質主要包括乙酰膽堿(AchE)、P物質(SP)等；抑制性遞質以非腎上腺素非膽堿能神經(NANC)遞質為主，包括一氧化氮(NO)、血管活性腸肽(VIP)、生長抑素(SOM)、降鈣素基因相關肽(CGRP)、三磷酸腺苷(ATP)等[13]。在結腸腸運動神經元的神經遞質中Ach和NO分別是興奮性和抑制性神經遞質的兩個典型代表[14-15]。AchE是重要的興奮性運動神經遞質，能使胃腸道平滑肌去極化，促進胃腸蠕動收縮。研究表明，大鼠回腸肌間神經叢內膽堿能神經減少能夠引起興奮性遞質減少，腸蠕動減慢，胃腸傳輸速率延遲[16-17]。另外，Ach使平滑肌細胞膜去極化，刺激腸道壁內膽堿能神經產生興奮性接頭電位(EJPs)，引起平滑肌收縮。NO是以L-精氨酸為底物，在還原性輔酶Ⅱ等因子輔助下由NO合成酶(NOS)催化生成。NOS包括三種亞型：神經型NOS(neuronal NOS,nNOS)、內皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)和誘導型NOS(inducible NOS,iNOS)。前兩者合稱為結構型NOS(constitutive NOS,cNOS)。研究發現nNOS主要分布于大鼠結腸黏膜下神經叢和肌間神經叢神經元，定位于細胞質。當NANC能神經受到刺激時，即釋放NO并迅速彌散至平滑肌，使其第二信使環磷酸鳥苷(cGMP)含量增多，使胞漿Ca2+外流并抑制Ca2+內流，致使胞漿游離Ca2+濃度降低，從而抑制肌動蛋白與肌球蛋白的結合，導致平滑肌舒張，胃腸運動減弱。另外，NO使平滑肌細胞膜超極化，產生抑制性接頭電位(IJPs)，而IJPs能破壞或減少環肌和縱肌自發性電節律性活動，降低慢波波幅值。此外，NO也可同其他神經遞質或神經肽相互協調，共同影響腸的生理功能。有報道成人功能性便秘患者結腸黏膜下神經叢和肌間神經叢NO陽性神經元數量和密度均較正常組明顯增多、增強、黏膜內NO生成量增加[18-19]。

以上實驗結果顯示，麻仁潤腸丸瀉下作用溫和、長期應用治療效果優于大黃、大黃素，而其副作用卻低于大黃、大黃素，長期應用不會出現嚴重的毒副反應，適合便秘老年患者長期應用。

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