子癇前期患者胎盤組織中TNF-α、Caspase-3表達的研究

王小梅 張維倩 任梅江 郭偉男

子癇前期患者胎盤組織中TNF-α、Caspase-3表達的研究

王小梅 張維倩 任梅江 郭偉男

目的 探討TNF-α、Caspase-3在子癇前期患者胎盤組織中的表達及意義。方法 子癇前期患者60例(包括子癇前期輕度、子癇前期重度各30例)為實驗組, 正常妊娠婦女30例為對照組, 利用免疫組織化學SP法檢測兩組胎盤組織中TNF-α、Caspase-3的表達。結果 實驗組TNF-α的表達均較對照組明顯升高(P＜0.05), 且隨著子癇前期的病情加重, TNF-α的表達逐漸增加。實驗組Caspase-3的表達均較對照組明顯升高(P＜0.05), 且隨著子癇前期病情的加重, Caspase-3的表達逐漸增加。結論 TNF-α、Caspase-3在患者胎盤組織中隨病情的加重逐漸升高的表達, 有助于預測子癇前期的發生發展。

TNF-α；Caspase-3；子癇前期；胎盤組織

子癇前期是妊娠期特有的疾病, 是妊娠期高血壓疾病的一種較嚴重類型。病變可累及多個器官, 嚴重影響母嬰健康, 為孕產婦和圍生兒高發病率及死亡率的主要原因之一。有研究表明, 血管內皮細胞損傷是子癇前期發病及病理變化的重要環節, 而TNF-α對血管內皮有直接的損傷作用［1］。Caspase-3是細胞凋亡中的重要蛋白酶, 已有研究表明, 胎盤合體滋養細胞凋亡和壞死形成的合體滋養細胞微粒增多是子癇前期發生的一個原因［2］。本研究通過測定TNF-α、Caspase-3在患者胎盤組織中的表達, 觀察其與子癇前期的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇于2012年5月～2014年1月在本院產科住院分娩的子癇前期患者60例(包括子癇前期輕度、子癇前期重度各30例)為實驗組, 其中子癇前期輕度患者的平均年齡(29.12±4.35)歲, 平均孕周(38.03±1.98)周；子癇前期重度患者平均年齡(29.34±4.03)歲, 平均孕周(37.78±2.17)周。選擇同期在本院分娩的正常妊娠婦女30例為對照組,平均年齡(29.23±5.41)歲；平均孕周(38.10±1.89)周(37～42周)。所有研究對象均無多胎妊娠、無反復流產史、未經生殖技術幫助、無慢性高血壓、糖尿病、無心血管疾病、慢性肝病腎病病史及免疫系統疾病。兩組孕婦一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 診斷標準 子癇前期輕度, 子癇前期重度的診斷標準參照謝幸、茍文麗第8版婦產科學［3］。

1.3 主要試劑 兔抗人TNF-α多克隆抗體購自北京博奧森物技術有限公司。鼠抗人Caspase-3多克隆抗體、SP免疫組化系列工作液試劑盒、DAB顯色液均購自北京中衫金橋生物技術有限公司。具體操作參照試劑盒說明書。

1.4 實驗方法 三組孕婦均于胎盤娩出后20 min內采集標本,從胎盤母體面中央切取胎盤組織約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm, 注意避開梗死及鈣化區。用生理鹽水反復沖洗, 用10%中性福爾馬林溶液固定24 h以上, 常規制成石蠟組織塊。采用免疫組化SP法測定胎盤組織中TNF-α、Caspase-3的表達。試驗設PBS代替一抗作為空白對照。

1.5 結果判定 將根據細胞內染色強度和陽性細胞數分級。根據染色強度分級：無染色或染色不清計為0分；淡黃色計為1分；少量深棕色顆粒計為2分；大量深棕色或褐色顆粒計為3分。估算陽性細胞數：無陽性細胞計0分；＜25%計1分；25%～50%計2分；＞50%計3分。取以上兩項積分之和：積分0～1分為(-)；2～3分為(+)；4～5分為(+)；＞5分為(+++)。

1.6 統計學方法 所有數據均采用SPSS13.0進行統計學處理, 計量資料采用單因素方差分析；計數資料采用χ2檢驗和秩和檢驗；變量間的相關分析采用Spearman等級相關分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α、Caspase-3兩者在對照組及子癇前期輕度、子癇前期重度中的表達。

2.1.1 TNF-α的表達 胎盤合體滋養細胞內可見TNF-α棕黃色陽性顆粒, 其主要表達于胞漿和胞膜。對照組胎盤組織中未見或僅見少量弱陽性細胞。而子癇前期輕度及重度組中TNF-α的表達量明顯增加。TNF-α在對照組的表達陽性率53.34%, 在子癇前期輕度組胎盤中表達的陽性率為83.33%,在子癇前期重度組胎盤中表達的陽性率約為96.67%。TNF-α在對照組、子癇前期輕度組及子癇前期重度組三組間均有不同程度的表達, 差異具有統計學意義(P＜0.05), 且隨著子癇前期的病情加重, TNF-α的表達逐漸增加。見表1。

表1 免疫組化中TNF-α在三組的表達［n(%)］

2.1.2 Caspase-3的表達 胎盤絨毛小葉的合體滋養細胞內可見Caspase-3棕黃色陽性顆粒, 主要表達于細胞漿, 部分于細胞核陽性表達。對照組胎盤組織中未見或僅見少量弱陽性細胞, 而子癇前期輕度及重度組中Caspase-3的表達量明顯增加。Caspase-3在對照組的中胎盤表達的陽性率為46.66%,在子癇前期輕度組胎盤中表達的陽性率為80.00%, 在子癇前期重度組胎盤中表達的陽性率約為93.33%。Caspase-3在對照組、子癇前期輕度組及子癇前期重度組三組間均有不同程度的表達, 差異具有統計學意義(P＜0.05), 且隨著子癇前期的病情加重Caspase-3的表達逐漸增加。見表2。

表2 免疫組化中Caspase-3在三組的表達［n(%)］

2.2 Caspase-3和TNF-α的相關性分析 子癇前期組：子癇前期輕度組兩者呈正相關, 相關系數r=0.678, P=0.008＜0.05；子癇前期重度組兩者呈正相關, 相關系數r=0.820, P=0.021＜0.05。對照組：兩者呈正相關, 相關系數r=0.542, P=0.000＜0.05。

3 討論

子癇前期是妊娠期特有的疾病, 是妊娠期高血壓疾病的嚴重類型, 其發病原因尚未完全闡明［4］。目前研究認為,血管內皮細胞損傷釋放血管活性物質, 是導致高血壓病的先兆［5］, 也是子癇前期病理變化的中心環節［6］。由于終止妊娠后多數患者的病理變化可以逆轉, 這說明胎盤在子癇前期的發病中起著重要的作用［7］。

妊娠期母體會出現一系列血管炎性反應的適應性變化,而子癇前期則使這種適應性變化發生紊亂。蛻膜中的細胞數量大大增加, 其激活時釋放的有害物質造成內皮損傷。TNF-α、IL-6和IL-8等細胞因子被命名為促炎性細胞因子, 這些細胞因子在細胞信號轉導系統中起重要作用, 調解著機體的生理功能, 而這些細胞因子又可以導致血管內皮細胞形態與功能的改變。有研究表明, TNF-α對血管內皮有直接的損傷作用, 并且妊娠高血壓病患者血中TNF-α含量的增高與血管內皮細胞損傷呈正相關［8］。而TNF-α在子癇前期的氧化應激中產生了重要作用, 造成產生吞噬脂質的巨噬細胞、血小板減少, 微血管凝血, 毛細血管通透性增加,致使脂質過氧化物產生增多, 從而損傷內皮。本實驗利用免疫組化法檢測了正常孕婦、子癇前期輕度與重度患者胎盤中TNF-α的表達。結果表明后兩者中TNF-α的表達較正常妊娠胎盤明顯增高。體外實驗證明, TNF-α可使血管內皮出現如下形態學改變：血管內皮細胞明顯拉長變形, 成為棱形甚至伸出長長的偽足；細胞表面微絨毛明顯縮短甚至脫落,且有的細胞表面絨毛呈泡狀結構, 可見細胞膜表面有缺損［9］, 胞內質網擴張, 線粒體濃縮、深染；細胞間連接疏松, 紅細胞可漏出管腔［10］。TNF-α除對血管內皮細胞造成直接損傷外, 還可能導致內皮細胞的功能紊亂, 如增加血管收縮因子(如內皮素)的生成和釋放, 減少血管舒張因子(如一氧化氮)的生成和釋放, 使血管調節因子失衡［11］。以上形態改變可致使血管受損、通透性增加和痙攣, 而導致血壓升高、蛋白尿和全身水腫。

Caspase-3屬于Caspase蛋白家族, 該類蛋白的活性部位為極保守的半胱氨酸殘基(以字母C代表), 它能特異性地切割(用aspase代表)天冬氨酸。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶, 主要表達于胎盤合體滋養細胞和細胞滋養細胞。研究表明, 胎盤合體滋養細胞凋亡和壞死形成的合體滋養細胞微粒(STBMs)在母體血液循環的增多是子癇前期發生的一個原因。合體滋養細胞微粒可誘導單核細胞產生TNF-α、IL-12、IL-18和INF-γ等炎性細胞因子［12］, 而且合體滋養細胞微粒是單核細胞強有力的活化劑, 通過 NF-κB(是將信息從胞漿傳至胞核引起相應基因表達的重要轉錄因子)信號傳達通路觸發炎癥系統［13］。另一方面, 同型半胱氨酸可以促進氧自由基的生成, 進而損傷血管內皮細胞, 致其功能紊亂［14］。而Caspase-3在子癇前期胎盤組織中表達增多, 證明其合體滋養細胞凋亡比正常妊娠組多, 相比于正常妊娠而言, 合體滋養細胞微粒進入母體血液循環增多, 繼而導致子癇前期的發生和發展。本實驗證實, Caspase-3在各組的胎盤中均呈陽性表達, 主要分布在胎盤的合體滋養細胞細胞漿, 部分分布于細胞核, 并且隨著子癇前期病情的加重而表達增加。

因此, 本實驗表明TNF-α、Caspase-3在對照組、子癇前期輕度組及子癇前期重度組的表達程度不同, 隨子癇前期病情進展, 二者的表達分別逐漸升高, 可能為該病發病的重要原因。病理性妊娠患者的胎盤中大量的TNF-α表達,刺激更多的炎性因子釋放, 加重血管內皮損傷, 且TNF-α、Caspase-3成正相關, 緊密聯系, 相互影響, 共同參與子癇前期發生及胎盤的病理改變。因此從分子生物學水平上的進一步研究, 有望揭示子癇前期的確切機制, 從而為該病的早期預防、早期治療提供有力的理論依據。

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2014-05-05］

050800 正定縣婦幼保健院