抗草甘膦轉基因大豆對雄鼠睪丸生殖細胞與精子的影響

蘆春斌，戚青林，周 文，蔡 娟，劉 標

(1.暨南大學生殖免疫研究所，廣東廣州510632;2.環境保護部南京環境科學研究所，江蘇南京210042)

中國是大豆的原產國，同時也是世界上最大的大豆進口國，而進口的大豆中80%以上是轉基因大豆［1］。轉基因大豆已成為我國大豆市場供應和消費的主體，轉基因大豆產品越來越多地進入食品生產與消費鏈。轉基因植物及其加工食品與人們的生活關系日益緊密，對其進行安全性的評估顯得尤為重要。目前對抗草甘膦轉基因大豆食用安全評估主要集中在組織病理學、臟器系數、血液學、生化分析等，大部分研究報道均表明轉基因大豆對實驗動物是安全的［2］。Laura［3］等以抗鱗翅類和甲蟲類昆蟲的轉基因玉米谷粒對大鼠進行亞慢性喂食，評價對大鼠攝食量、體重增長、臨床觀察、眼科、神經行為學、臨床病理學和解剖病理學的影響，其結果顯示均無顯著性影響。He［4］等以富含賴氨酸的轉基因玉米對大鼠進行90d亞慢性毒理研究，研究證明該轉基因玉米喂食對大鼠體重、食物吸收和利用率、血液學、血清化學、組織病理學等均無顯著性影響。雄性生殖器官睪丸、附睪等是一種很敏感的靶標器官，無論對外界化學相關污染還是生物因素都極敏感，它們對睪丸附睪的傷害作用往往早于對其他器官的傷害，在毒理學評估中意義很重要。雖然國內外對抗草甘膦轉基因大豆在動物胚胎發育和生殖功能方面的研究已有一些報道，但是轉基因大豆飼料對雄性嚙齒類動物的雄性生殖器官發育和功能，尤其是對早期精細胞、附睪精子頂體形態結構和功能的影響的研究極少。本實驗對30d短期和90d長期喂食抗草甘膦轉基因大豆的小鼠進行了生殖細胞發育、精子頂體形態結構和功能的生殖毒理研究，為評估抗草甘膦轉基因大豆的生物安全性提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斷乳的昆明小鼠(SPF級)由暨南大學醫學院動物中心提供;吉姆薩染液、孕酮、絡合異硫氰酸熒光素的豌豆凝集素(FITC－PSA)、二甲基亞砜 Sigma;注射用環磷酰胺 江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ECLIPSE TE200型光學顯微鏡 日本尼康公司;MCO－175型CO2培養箱 日本三洋公司;Centrifuge 5415型微型高速離心機 德國Eppendof公司;E400型熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 實驗動物分組及處理

將216只離乳后的昆明品系雄性小鼠在實驗室以非轉基因大豆飼料適應性飼養一周后，再隨機分為3組，每組72只;第1組喂食轉基因大豆豆粕加工的飼料作為實驗組(GM組)，第2、3組喂食非轉基因大豆豆粕加工的飼料作為對照組，其中2組除喂食非轉基因大豆飼料外不做其他處理作為陰性對照組(CK組)，此外第3組小鼠在每次實驗取樣前兩周小鼠腹腔注射環磷酰胺作為陽性對照組(CP組)，注射劑量80mg/kg/鼠［5］。按國家實驗動物飼養標準喂食，在喂食30、60、90、120d 后每次取 GM 組、CK 組、CP 組各 6只小鼠進行精細胞早期微核實驗，其余小鼠在喂食30、60、90、120d后每次取 GM 組、CK 組、CP 組各6只小鼠進行頂體完整率和頂體反應率實驗。動物實驗期間飼養條件為，室內溫度22～24℃，室內濕度40%～70%，光照時間為12h，12h黑暗，動物自由取食飲水。

1.4 飼料

實驗用轉基因豆粕為孟山都公司(Monsanto)的抗除草劑大豆GTS40－3－2，非轉基因豆粕為其親本品種A5403，動物飼料委托廣東省實驗動物中心進行加工，飼料中的各種成分比例參照國家標準中實驗動物配合飼料營養成分標準(GB 14924.3－2001))以玉米、魚粉、麩皮、豆粕和小麥等為主要原料(其中豆粕比例為15%)，并添加單體礦物質和復合維生素，經混合機混勻后進行加工調制制成圓筒狀，常溫保存。對照組飼料中豆粕全部為非轉基因豆粕，而實驗組飼料中以15%的轉基因豆粕代替非轉基因豆粕，其余與前者相同。

1.5 實驗方法

1.5.1 小鼠睪丸早期精細胞的微核出現率 參考張才［6］等實驗方法并加以改進，將小鼠脫頸椎處死，迅速摘取一側睪丸，置于加有3mL睪丸細胞分離液(Tim液)的小平皿中，去除被膜，將曲細精管剪成碎段，反復吹打后，經200目篩網過濾到5mL離心管中，以500r/min離心5min，棄上清，加Tim液洗滌細胞兩次，再加1.5mL的Tim液制成細胞混懸液。取10μL細胞懸液推片，自然干燥，甲醇固定30min，涼干，用1∶9的吉姆薩－磷酸緩沖液(pH6.8)染液染色30min，蒸餾水輕輕沖洗載玻片，自然晾干。采用雙盲法油鏡下每只動物計數1000個早期精細胞，統計其微核(MN)細胞率，微核率以千分率表示。微核率按下式計算:早期精細胞微核率(‰)=含微核的早期精細胞數/計數的早期精細胞總數×1000。

1.5.2 小鼠精子頂體完整率的檢測 參考郭名和［7］等實驗方法并加以改進，頸椎脫臼處死小鼠，解剖后取雙側附睪尾置于1mL濃度為0.9%的生理鹽水中，培養皿置于37℃ CO2培養箱中孵育十分鐘，精子懸液2000r/min，離心10min。將精液用濃度為0.9%的生理鹽水離心清洗兩次，棄去上清，剩余沉淀用新鮮生理鹽水適量重懸。取10μL精液置于干凈載玻片上，均勻推片，每只小鼠制備兩張片子。室溫晾干后于95%乙醇中固定30min，自然涼干。在暗房中將載玻片置于PSA－FITC染色缸中，染色4h。取出后在暗房中用雙蒸水沖洗，熒光顯微鏡鏡檢，計數500個精子中頂體形態結構完整性。頂體完整率(%)=頂體完整的精子數/總檢測精子數×100。

1.5.3 精子頂體反應率的檢測 參考邵佇雄［8］等實驗方法并加以改進，將小鼠脫頸椎處死后，取兩側附睪尾置2mL HTF培養液中剪碎，取上述精液稀釋后計數，取1×106精子，稀釋至1mL;37℃ CO2培養箱內孵育1h，使精子獲能;在獲能精子懸液中加入10μL濃度為1mg/mL孕酮(終濃度為10μg/mL)(二甲基亞砜(DMSO)的終濃度 ＜1%)，繼續在 37℃CO2培養箱孵育30min誘導頂體反應。將已誘導頂體反應后的精子懸液2000r/min，離心10min。沉淀用HTF培養液洗滌精子2遍，適量HTF培養液懸浮沉淀，混勻，取該精子懸液10μL進行精子涂片，室溫晾干后于95%乙醇中固定30min，自然涼干。在暗房中將載玻片置于PSA－FITC染色缸中，染色4h。取出后在暗房中雙蒸水沖洗，熒光顯微鏡鏡檢，計數500個精子中頂體反應率。頂體反應率(%)=發生頂體反應的精子數/總檢測精子數×100。

1.5.4 統計分析 應用 SPSS17.0軟件進行數據錄入。統計分析采用方差分析，結果采用x±s表示。組間差異進行方差分析后，再用t檢驗，以p＜0.05為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 抗草甘膦轉基因大豆對小鼠睪丸早期精細胞微核率的影響

GM組、CK組和CP組在喂食時間分別30、60、90和120d后處死小鼠，取睪丸進行早期精細胞微核實驗，圖1為在光學顯微鏡油鏡下的睪丸早期精細胞，箭頭所指即為出現微核的睪丸早期精細胞。30d短期喂食實驗結果經方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK陰性對照組相比，微核率沒有統計學差異(p＞0.05)，CP組微核率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。30d急性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉基因大豆對小鼠生殖細胞染色體不會造成損傷，環磷酰胺導致小鼠生殖細胞染色體發生嚴重損傷，說明所選陽性對照可靠。90d長期喂食實驗結果經方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK陰性對照組相比，微核率沒有統計學差異(p＞0.05)，CP組微核率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。90d亞慢性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉基因大豆對小鼠生殖細胞染色體不會造成損傷，環磷酰胺導致小鼠生殖細胞染色體發生嚴重損傷，說明所選陽性對照可靠。結果如圖2所示。

圖1 光學顯微鏡1000×油鏡下的睪丸早期精細胞Fig.1 Early testicular sperm cells viewed under optical microscope using a 1000×oil immersion objective

圖2 抗草甘膦轉基因大豆對小鼠早期精細胞微核率的影響Fig.2 Effect of GM soybean on micronucleus of early testicular sperm cells in mice

2.2 抗草甘膦轉基因大豆對小鼠精子頂體形態結構的影響

實驗期內，各組實驗動物均未有死亡。GM組、CK組和CP組在喂食30、60、90、120d后取附睪精子進行實驗，如圖3示為精子經FITC－PSA染色后在熒光顯微鏡油鏡下觀察到的熒光照片與對應的相差顯微照片，箭頭所指為頂體異常精子，其他為正常頂體精子。如圖3所示，正常精子頂體區域熒光亮，頂體與核間熒光微弱，核及核后無熒光，異常頂體精子常表現為頂體區域缺失、不完整。30d短期喂食實驗結果經方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK組相比，頂體完整率無統計學差異(p＞0.05)，CP組頂體完整率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。30d急性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉基因大豆對小鼠精子頂體形態結構沒有影響，環磷酰胺導致小鼠精子頂體形態發生異常，說明所選陽性對照可靠。90d長期喂食實驗結果經方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK組相比，頂體完整性無統計學差異(p＞0.05)，CP組頂體完整率較 GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。90d亞慢性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉基因大豆對小鼠精子頂體形態結構沒有影響，環磷酰胺導致小鼠精子頂體形態發生異常，說明所選陽性對照可靠。結果如圖4所示。

圖3 熒光顯微鏡油鏡下的FITC－PSA熒光染色照片(1000×)Fig.3 Fluorescent dye FITC－PSA photos under oil immersion objective(1000×)

圖4 抗草甘膦轉基因大豆對小鼠精子頂體完整性的影響Fig.4 Effects of GM soybean on the acrosome integrity to mice sperm

2.3 抗草甘膦轉基因大豆對小鼠精子頂體反應率的影響

實驗期內，各組實驗動物均未有死亡。GM組、CK組和CP組在喂食30、60、90、120d后取附睪精子進行實驗，圖5A、圖5C為精子經FITC－PSA染色后在熒光顯微鏡油鏡下觀察到的熒光照片與對應的相差顯微照片，如圖所示，頂體完整的精子整個精子頭部的頂體區表現為明亮的熒光，而發生頂體反應的精子只有赤道區有熒光標記，圖5B、圖5D為對應精子的相差顯微照片。30d短期喂食實驗結果經方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK組相比，無統計學差異(p＞0.05)，CP組頂體反應率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。30d急性毒理研究表明短期喂食抗草甘膦轉基因大豆對小鼠精子受精能力沒有影響，環磷酰胺導致小鼠精子頂體反應發生異常，說明所選陽性對照可靠。90d長期喂食實驗結果經方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK組相比，無統計學差異(p＞0.05)，CP組頂體反應率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。90d亞慢性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉基因大豆對小鼠精子受精能力沒有影響，環磷酰胺導致小鼠精子頂體反應發生異常，說明所選陽性對照可靠。結果如圖6所示。

圖5 熒光顯微鏡油鏡下的FITC－PSA熒光染色照片(1000×)Fig.5 Fluorescent dye FITC－PSA photos under oil immersion objective(1000×)

圖6 抗草甘膦轉基因大豆對小鼠精子頂體反應率的影響Fig.6 Effects of GM soybean on the ratio of acrosome reaction

3 結論與討論

隨著全球對糧食需求加劇及基因工程技術的發展使轉基因作物及其產品越來越多地進入人們的生活，轉基因產品食用安全性問題在世界范圍內引起廣泛關注。關注的焦點是轉基因產品是否具有潛在的風險如過敏性、食品毒性、導致抗生素抗性及對環境影響［9］等。哺乳動物的生殖器官睪丸對外界化學物質的作用十分敏感，在其他組織器官還未出現毒性反應之前，睪丸組織可能已經出現損害作用［10］。研究表明外界因子如壬基酚透過血睪屏障影響生精細胞、支持細胞和間質細胞的功能，干擾機體內分泌平衡［11］，從而使雄鼠生殖功能受到損害［12］。精子質量是影響雄性哺乳動物生育能力的關鍵因素，WHO規定把精子頂體反應率，精子膜功能完整性作為評價精子受精功能的重要指標［13］。Denise［14］等用抗草甘膦轉基因大豆喂食孕鼠，親代及子代雄鼠睪丸細胞流式檢測發現，睪丸細胞總體(單倍體、二倍體和四倍體)百分數和對照組相比沒有差異。唐茂芝［15］等用轉基因棉籽喂食雄性大鼠，未發現大鼠睪丸組織出現明顯病理損傷。張琳晗［16］等用轉Bt玉米短期喂食小鼠，發現與正常對照組相比，高、中、低劑量組小鼠精子畸形率沒有影響。田源［17］等用轉基因番茄汁染毒小鼠，發現與正常對照組相比，各劑量轉基因番茄汁染毒小鼠精子畸形率均無統計學意義。Xing［18］等用高賴氨酸轉基因大米對大鼠進行三代喂食，發現未對精子各項參數造成影響。

本課題組在前期實驗中，根據國家飼料標準(GB 14924.3－2001)，我們以 Monsanto 公司的抗草甘膦轉基因大豆豆粕為實驗材料，分別設置了轉基因大豆高劑量組(15%轉基因豆粕)、中劑量組(10%轉基因豆粕+5%非轉基因豆粕)、低劑量組(5%轉基因豆粕+10%非轉基因豆粕)，及非轉基因大豆對照組進行昆明鼠30d和90d喂食實驗，實時熒光定量PCR檢測小鼠睪丸發育與精子功能相關的一些基因mRNA的表達譜變化。與非轉基因大豆組相比，未發現高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠睪丸發育與精子功能相關的一些基因mRNA表達水平有顯著性變化，轉基因豆粕不同比例的3組之間也無差異(數據未列出)，故本文實驗只設計了轉基因大豆高劑量組和非轉基因大豆組這兩組。本課題組前期研究結果也表明，抗草甘膦除草劑轉基因大豆飼料短期喂食30d和長期喂食90d均未對小鼠精子畸形率和存活率、睪丸細胞生殖周期比例、精子DNA損傷等造成顯著影響［19－20］。本實驗以雄性小鼠的為靶標器官，進一步分析轉基因大豆對睪丸早期精細胞微核率、精子頂體完整率和頂體反應率的影響，探討其是否會導致小鼠睪丸早期精細胞發生染色體畸變，是否影響小鼠精子質量和受精能力，從而評估喂食抗草甘膦轉基因大豆對小鼠的生殖毒理學作用。抗草甘膦轉基因大豆對小鼠進行30、60、90和120d喂食后檢測其睪丸組織早期精細胞微核率、附睪精子頂體完整率及頂體反應率變化，發現與對照組相比，轉基因大豆飼料組小鼠的睪丸組織早期精細胞微核率、精子頂體完整率和反應率均無統計學差異，表明抗草甘膦轉基因大豆30d急性毒理喂食和90d亞慢性毒理喂食均不會引起小鼠睪丸早期精細胞染色體發生畸變，同樣也不會對精子頂體完整性和頂體反應造成影響，即不會對雄性小鼠的精子質量和受精能力造成潛在的毒理學作用，據此和我們前期的相關研究結果都證明了抗草甘膦轉基因大豆飼料30d和90d的攝食對雄性小鼠沒有潛在的生殖毒理作用，不會對小鼠小鼠精子發育和功能造成影響。

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