紡織技術構建組織工程肌腱支架的研究進展*

(東華大學紡織面料教育部重點實驗室，上海，201620)

肌腱損傷是從事體育運動人群的常見損傷之一。肌腱損傷較難完全治愈，復發率高，且治療成本較為昂貴，恢復周期很長。目前肌腱損傷的治療方法主要有自體肌腱移植、同種異體肌腱移植和肌腱假體替代物三種方法，均存在某些弊端。自體肌腱移植存在肌腱供區缺損的問題，且供區肌腱多為無滑膜的肌腱，而嚴重影響功能的肌腱缺損多為有滑膜肌腱。同種異體肌腱移植若為具有活性的異體肌腱移植，會引起嚴重的免疫排斥反應；而經過冷凍干燥處理后的同種異體肌腱移植，則保存的僅是膠原纖維，將來仍需要自體肌腱細胞進行替代。人工肌腱假肢雖然近期生物力學強度較好，但遠期終會發生降解，而且會引起感染致假肢排出體外。

隨著材料學和生物醫學的發展，組織工程肌腱移植有望成為永久性治愈肌腱損傷的理想方法。組織工程生物材料所形成的三維結構支架不但為細胞獲取營養、生長和代謝提供了一個有利的空間，也為植入的細胞分泌細胞外基質并最終形成相應的組織或器官提供一個良好的環境[1-2]。因此，組織工程肌腱支架的研究是組織工程肌腱的重要研究內容之一。

1 組織工程肌腱支架設計

1.1 組織工程學概念及原理

20世紀80年代末，美國華裔科學家Fung Y C教授首次提出了組織工程學的命名，并于1987年被美國國家科學基金會采納。1993年美國組織工程研究的先驅者麻省理工學院Robert Langer教授和哈佛大學Joseph Vacanti教授在《科學》雜志上發表了有關組織工程科學發展前景的文章[1]。此后，組織工程學在世界各國得到迅猛發展，成為醫學生物研究領域發展最快的一門學科。

組織工程學是一門以細胞生物學和材料學相結合，進行體外和體內構建組織或器官的新興學科。該學科的基本原理是：從機體獲取少量的活體組織，用特殊的酶或其他方法將細胞(又稱種子細胞)從組織中分離出來并在體外進行培養擴增，然后將擴增的細胞與具有良好生物相容性、可降解和可吸收的生物材料按一定的比例混合，使細胞黏附在生物材料上形成細胞—材料復合物；將該復合物植入機體的組織或器官病損部位，隨著生物材料在人體內逐漸被降解吸收以及植入的細胞在體內不斷增殖并分泌細胞外基質，最終形成相應的組織或器官，從而達到修復創傷和重建功能的目的[3]。

與其他傳統方法相比，組織工程化人工肌腱修復缺損肌腱主要有以下優點[4]：

(1)所形成的肌腱組織有活力和功能，可對肌腱缺損進行形態修復和功能重建，并達到永久性替代；

(2)以相對少的肌腱細胞經體外培養擴增后，修復嚴重的肌腱缺損；

(3)按缺損肌腱形態任意塑形，達到形態修復。

1.2 組織工程肌腱支架的設計原則

組織工程的研究涉及種子細胞、生物可降解材料和組織構建三方面的內容。作為種植細胞支架的生物可降解材料，是對細胞外基質的仿生，是保證組織工程化形成的前提，必須具有細胞外基質的功能和作用。因此，組織工程用細胞支架一般應當具有以下一些性質[5-6]：

(1)良好的生物相容性。支架材料除滿足生物材料的一般要求(如無毒、不致畸等)外，還要利于種子細胞黏附、增殖，降解產物對細胞無毒害作用，不引起炎癥反應，甚至利于細胞生長和分化。

(2)良好的生物降解性。支架材料在完成支架作用后應能降解，降解速率應與組織細胞生長速率相適應，降解時間應能根據組織生長特性作人為調控。

(3)具有三維立體多孔結構。支架材料可加工成三維立體結構，孔隙率最好達90%以上，具有較高的面積體積比。三維立體多孔結構可提供寬大的表面積和空間，利于細胞黏附生長、細胞外基質沉積、營養和氧氣進入及代謝產物排出，也有利于血管和神經長入。

(4)可塑性和一定的強度。支架材料應具有良好的可塑性，可預先制作成一定形狀；具有一定的強度，可為新生組織提供支撐，并保持一定時間直至新生組織具有自身生物力學特性。

(5)良好的材料—細胞界面。支架材料應能提供良好的材料—細胞作用界面，利于細胞黏附、生長，更重要的是能激活細胞特異基因表達，維持正常細胞表型表達。

(6)良好的消毒性。支架材料應能適應簡便而有效的消毒技術和方法，以利于組織工程構建前對支架進行徹底消毒。

2 組織工程肌腱支架形態

細胞支架不僅為特定細胞提供結構支撐作用，而且還起到模板作用，引導組織再生和控制組織結構。因此，在組織工程中，除了考慮材料的化學性質、表面性能外，還應考慮三維支架的結構，如結構形狀，孔隙的形態、大小、連通性和孔隙率等，以便于細胞的黏附、滲透和營養物質的傳送以及代謝產物交換等，而這些性質取決于肌腱支架的制備方法[7-8]。目前紡織結構常用的支架形態包括纖維狀支架、管狀支架和多元混構型支架等。

2.1 纖維狀支架

2.1.1 三維分層纖維支架

通過傳統的紡織技術容易制備多孔隙的織物，可用于組織工程肌腱支架。目前正在研發纖維積層技術和三維立體紡織技術來構建三維層狀纖維結構支架。

Atsuyuki等[9]用直徑為23 μm的聚左旋乳酸(PLLA，相對分子質量86 000)纖維為原料，制成平紋機織物(織物P)和雙層結構織物(織物D，見圖1)兩種結構的織物。平紋機織物表面光滑，而雙層織物一側光滑，另一側呈毛絨須條狀。將兩種織物分別植入兔子背部，對術后3和6 w時的織物組織學和力學性能進行研究。術后3 w，織物P纖維間細胞很少，而織物D光滑一側有大量細胞黏附，另一側有大量細胞向內遷移；術后6 w，織物P間隙遷移細胞很少，而織物D毛絨須條狀一側出現條狀再生組織。在脫氧核糖核酸(DNA)數量上，織物D為(63.4±12.2) μg/cm2，而織物P為(14.6±2.2) μg/cm2。在力學性能方面：織物D斷裂強力在術前為(24.3±0.9) N，3 w時為(32.0±4.2) N，6 w時為(23.6±5.4) N，最終強力僅下降3%，斷裂功下降24%；織物P斷裂強力在術前為(76.6±3.5) N，3 w時為(67±16.4) N，6 w時為(44.0±3.4) N，最終強力下降了43%，斷裂功下降62%。之后，Atsuyuki等[10]又研究了無細胞雙層PLLA支架在肌腱重建中的應用。將無細胞雙層PLLA支架和原岡下肌肌腱分別移植到兔子岡下肌受損處進行修復，分別在術后0、4、8和16w時對其組織學和力學性能進行分析。術后4 w，支架毛絨狀一側間隙出現細長紡錘狀細胞，并且支架內部出現纖維狀組織；術后8 w，細長紡錘狀細胞遷移到支架內部，再生組織與骨骼開始連接在一起；術后16 w，類似膠原的纖維組織出現在支架內部，并且部分纖維開始被吸收。支架在0、4、8和16 w時的斷裂強力分別為(21.3±4.2)、(52±14.7)、(69±8.4)和(68.8±12.7) N，剛度分別為(2.6±0.46)、(7.8±2.5)、(8.1±2.5)和(11.1±3.1) N/mm；而原岡下肌肌腱在0、4、8和16 w時的斷裂強力分別為(16.9±6)、(61.7±9.5)、(78±26.3)和(69.4±14.9) N，剛度分別為(2.42±0.32)、(7.3±2.6)、(11.0±3.1)和(10.2±1.4) N/mm。雙層PLLA支架的斷裂強力和剛度與正常肌腱組織沒有明顯差異，且細胞生長較好，因此Atsuyuki認為這種新型的雙層PLLA支架具有誘導細胞向組織內部遷移的潛力，并且其力學性能與正常岡下肌肌腱類似。

Caliari等[11]以膠原—黏多糖為原料制成“芯—鞘”結構的雙層復合支架[圖2(c)]，其中：“芯”部由低密度、各向異性的膠原—黏多糖纖維

圖1 雙層結構織物D

束支架組成[圖2(a)]；“鞘”部由高密度、各向同性的膠原—黏多糖薄膜組成[圖2(b)]。雙層復合支架“芯”部直徑為6～8 mm，長度為15～30 mm，孔徑為(243±29) μm，拉伸模量為(833±236) kPa；“鞘”部薄膜外徑為12 mm，長度為45 mm，垂直纖維方向和平行纖維方向的拉伸模量基本相同，分別為(636±47)和(693±20) MPa。“芯”部的高孔隙率為細胞生長提供了環境，“鞘”部為支架提供足夠強力，滿足了多孔組織工程肌腱支架力學性能和生物相容性相結合的要求。

圖2 “芯—鞘”雙層復合結構肌腱支架

2.1.2 纖維黏接支架(非織造網孔支架)

將生物可降解纖維相互黏接在一起形成多孔性空間結構，為細胞生長和細胞間相互作用提供較大表面積[12]。

目前常用生物可降解材料聚乙交酯(PGA)的黏接技術有兩種。一種方法由Mikos等[13]提出，將PGA纖維浸入PLLA溶液中，在溶劑蒸發后，兩種聚合物形成復合物，此時PGA纖維網狀物就嵌入到PLLA里；然后將復合物加熱，隨著PGA纖維的熔化，在交叉點的纖維會出現“焊接”現象，從而形成多孔載體材料(圖3)。該支架材料的孔隙率可達到80%，孔徑也能達到500μm。另一種方法是使用霧化的PLLA或聚乙交酯—丙交酯(PGLA)，先溶解在氯仿中，然后直接將其噴射到PGA纖維上。Mooney等[14]采用該方法將PGA材料制成管形，并將該管狀材料植入小鼠組織中，17 d后觀察到有纖維狀組織生長，表明采用該材料制成的支架有可能促進新生組織的形成。

圖3 纖維黏結支架的制備流程

2.1.3 非織造纖維支架

將PGA進行熔體紡絲得到長絲束，切斷成短纖維后借助針刺技術制成非織造布。通過纖維直徑和針刺后熱壓條件的改變，可在一定程度上調整支架的孔隙率和厚度。

George等[15]首先設計了非織造網狀纖維支架力學模型，通過模型預測支架的拉伸強度和剛度，而后以PGA和PLLA纖維為原料，制作了PGA支架、PLLA支架及PGA/PLLA(50∶50)混合支架(圖4)，通過實驗測試了三種支架的拉伸強度和剛度。模擬所得PGA支架、PLLA支架和PGA/PLLA混合支架沿纖維軸向(PD)的剛度分別為306、168和222 kPa；而實驗測得的PD剛度值分別為(284±34)、(171±14)和(206±16) kPa，且垂直纖維軸向(XD)剛度約為PD方向剛度的1/3。因此，George 認為通過結構模型能夠預測所設計支架的剛度。

圖4 非織造網狀混合支架

2.1.4 靜電紡納米纖維支架

在一定條件下，受靜電排斥力、庫侖力和本身表面張力的共同作用，聚合物細流會沿著不穩定的螺旋軌跡彎曲運動，在幾十毫秒內被牽伸千萬倍，從而形成納米級至亞微納米級超細纖維[16]。在納米混合支架中，由于納米纖維比表面積大、孔隙率高，有利于細胞的黏附和細胞外基質的傳遞，并且納米纖維與肌腱細胞外基質的天然納米結構相似，能促進骨髓基質干細胞分泌肌腱特定的基質，而支架部分作為承受載荷的增強體。

Sahoo等[17]首先以PGLA(GA∶LA=90∶10)為原料，制備了緯平針結構的針織支架，然后利用靜電紡絲技術將納米纖維噴附在針織支架上，制成混合納米微纖支架(圖5)。該支架具有較大的比表面積，有利于細胞的黏附。納米纖維直徑為300～900 nm，支架厚度為0.8～1.3 mm，孔徑為2～50 μm。對支架進行體外降解和力學性能測試，發現其初始拉伸斷裂強力為(56.3±6.66)N，降解14 d后下降為(1.82±0.6)N；初始彈性剛度為(5.80±0.7)N/mm，降解14 d后為(0.64±0.1) N/mm。將豬的骨髓間充質干細胞(BMSC)接種到納米纖維支架上，發現36 h后細胞就開始黏附在支架上，1 w時增殖細胞和細胞外基質混合良好，2 w時支架力學性能良好。該新型納米混合緯編支架能夠促進細胞接種、細胞增殖、細胞分化及細胞多樣化，可以很好地應用在組織工程肌腱移植上。

圖5 緯平針結構納米微纖支架

Zhang等[18]研究了肌腱修復用仿生支架的功能性和整合性設計，強調肌腱移植的關鍵不僅在于移植支架具有較好的生物力學性能，并且能夠促進正常腱—骨界面整合，通過使用納米纖維或基于納米纖維的復合材料支架可以實現組織工程肌腱修復的仿生設計。

Mathew等[19]以纖維素纖維為原料，制成了納米纖維支架，并進行了生物力學性能實驗。第一步將纖維素纖維溶解在溶劑中形成溶液，然后利用溶液制成納米纖維，進而制成質量分數為0.5%的納米纖維懸浮液，然后在100 ℃下烘干1 h，在60 ℃、35 MPa下處理6 h，即得纖維素納米纖維網狀支架NF0；第二步在完全真空容器中烘干NF0，再用15 mL等離子液在80 ℃下分別處理90和120 min，得到兩種不同溶解度的纖維素納米復合材料NF90和NF120。在室溫條件下進行力學性能測試，NF0、NF90和NF120的拉伸強度分別為(105.9±5.5)、(112.2±6.5)和(117.9±6.6) MPa，模量分別為(6.6±0.5)、(8.2±0.8)和(6.8±0.6) GPa，斷裂伸長率分別為(10.3±0.6)%、(7.4±0.8)%和(12.8±1.4)%，而正常肌腱的拉伸強度為28～38 MPa、斷裂伸長率為18%～30%[20]，即納米纖維支架強度明顯優于正常肌腱，但斷裂伸長率不滿足使用要求。Mathew等[19]經過進一步研究發現，納米纖維復合支架在模擬人體環境下測試的力學性能與室溫下測量值存在差異。在人體環境下，NF0、NF90和NF120的拉伸強度分別為(64.5±4.9)、(36.2±3.3)和(37.4±2.8) MPa，斷裂伸長率分別為(23.4±2.1)%、(21.3±3.8)%和(20.0±3.1)%，即強度和斷裂伸長率都滿足肌腱使用要求，并且細胞在幾種支架上黏附、增殖、分化良好。因此，Mathew認為纖維素納米纖維復合支架在肌腱重建中具有潛在的應用市場。

Li等[21]用聚己內酯(PCL)和PGLA作為原料，將碳酸鈣粉末通過靜電紡絲技術涂覆在纖維支架表面，形成梯度納米纖維復合支架(圖6)。將小鼠前成骨細胞(MC3T3)接種到梯度納米纖維混合支架上，發現細胞在支架上黏附、增殖、分化良好，并且支架剛度較大。這種方法可以滿足組織工程肌腱—骨連接修復要求，今后有望在臨床中得到應用。

圖6 梯度納米纖維復合支架

Chen等[22]首先制作了一個針織蠶絲支架，將海綿狀蠶絲填充在孔隙上，對支架進行鈦納米纖維(RADA16)涂層，得到混合支架(圖7)。支架的孔隙約50～200 μm，將骨髓間充質干細胞(BMSC)接種到支架上，進行3 w的體外培養實驗。與未進行RADA16涂層的支架相比，涂層支架上BMSC大量增殖，新陳代謝旺盛，細胞分化良好；細胞外基質中生腱蛋白含量明顯增加，膠原蛋白和黏多糖增加，且最大拉伸載荷比未涂層支架高7%。這種鈦納米纖維涂層技術在韌帶組織工程修復中具有潛在的應用市場。

2.2 管狀支架

纖維狀的材料在構建復雜型細胞支架時具有一定的優越性。纖維狀支架的不足之處在于孔隙率和孔尺寸不易控制，亦不易獨立調節。而管狀支架具有結構穩定、孔隙率和孔徑可調節等優點，已廣泛應用于組織工程肌腱支架的構建。目前用于管狀支架構建的紡織技術有編織，針織(緯編、經編)和非織造等技術。

2.2.1 編織類支架

編織是一組紗線沿0°方向延伸，而且所有紗線都偏移一個合適的角度，然后交織在一起形成織物的過程。肌腱呈束狀，因此選用編織法作為肌腱支架的形成方式有其合理性。

圖7 針織蠶絲鈦納米纖維復合支架

Coopera[23]以PGLA(GA∶LA=90∶10)長絲(5.78 tex)為原料，采用編織的方法編織韌帶支架(圖8)，并對支架進行了體外研究。研究表明，編織支架的極限抗張強度為100～400 MPa，應力—應變曲線與人體正常韌帶組織相似。

圖8 編織類支架

Lu等[24]分別以PGA、PGLA(GA∶LA=18∶82)、PLA長絲為原料，用圓形編織法分別制作了三種前交叉韌帶支架(圖9)。所得三種支架的編織角、表面積、孔隙率和平均孔徑沒有明顯區別，支架孔隙率在54%～63%之間，平均孔徑為177～226 μm，纖維直徑為15～25 μm。

圖9 圓形編織法編織支架

Tovar等[25]以聚芳酯(DTD DD)、Ⅰ型膠原蛋白為原料，采用圓形編織法編織聚芳酯/膠原(75∶25)混合支架(圖10)，并進行了體內研究。將進行滅菌處理后的支架植入芬蘭綿羊前交叉韌帶受損處，在移植4和12 w后分別分析細胞內生長情況和支架的強力保持率。4 w后，混合支架的斷裂強力由(944±162) N降為(314±11) N，剛度由(202±46) N/mm降為(86±4.4) N/mm；12 w后，混合支架結構完好，其斷裂強力降為(42±22) N，剛度降為(9±3) N/mm。Tovar等指出，對于前交叉韌帶重建，組織內生長是可降解支架獲得成功的關鍵。

圖10 編織類聚芳酯/膠原混合支架

2.2.2 緯編針織類支架

緯編是將紗線沿緯向喂入針織機的工作織針，順序地彎曲成圈并相互穿套而形成針織物的一種工藝。與編織結構相比，緯編針織結構具有更高的孔隙率，能為組織向內生長提供更多的空間。

Ouyang等[26]以PGLA(GA∶LA=90∶10)為原料，制作緯平針結構針織支架，對針織復合支架在肌腱重建中組織學和生物力學性能進行了研究(圖11)。首先制作三組支架：支架Ⅰ接種骨髓間充質干細胞(BMSCs)，支架Ⅱ不接種BMSCs，支架Ⅲ為正常肌腱；然后將三組支架移植到白兔受損肌腱處，進行12 w的重建手術。研究發現：術后2和4 w，支架Ⅰ比支架Ⅱ具有更好的組織結構和組織形態；而術后8和12w，支架Ⅰ與支架Ⅱ的形態與正常肌腱相似，且新生成的肌腱組織的成分主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白；術后12 w，支架Ⅰ的拉伸剛度和模量分別達到正常肌腱的87%和(62.6±13.1)%，而支架Ⅱ的拉伸剛度和模量分別達到正常肌腱的56.4%和(52.9±13.8)%。

陶沙等[27]以PGA和PLA長絲為原料進行合股編織，將編織線在小口徑圓筒針織機上進行緯平針織造，通過改變編織過程中彎紗深度、牽拉力和給紗張力等工藝參數，可以得到不同幾何性能的緯平針支架，并對不同支架進行了體外降解實驗。研究表明，彎紗深度、牽拉力和給紗張力都對支架的口徑、孔隙率、密度和斷裂強力有影響，且緯平針支架在降解過程中力學性能的衰減主要發生在前2 w，而質量損失在3 w后變化明顯。

2.2.3 經編針織類支架

由于技術上的限制，將經編織物做成小孔徑管狀結構比較困難，因此對于經編支架目前僅限于平面結構的研究。Chen等[28]以蠶絲和膠原蛋白為原料制備了經編針織支架，支架孔隙大小約為1 mm×1 mm(圖12)，將骨髓間充質干細胞(BMSC)接種到支架上進行動物體內實驗。體內移植12 w后，支架拉伸強力下降了19.6%，從(46.5±9.2) N降為(37.4±3.8) N。通過掃描電鏡觀察到膠原海綿狀微孔主要是蠶絲支架的孔隙部分，并且蠶絲和膠原蛋白相互黏結在一起。

圖12 經編針織支架結構

2.2.4 中空纖維紡絲法

用中空纖維紡絲器可以制備中空纖維管。王光林等[29]用相對分子質量73萬的生物可降解聚乳酸(PDLLA)和添加劑一起溶解在溶劑中，除泡后用中空纖維紡絲器通過干濕紡絲法，制成外徑為213 mm、內徑為119 mm、壁厚0.14 mm、長4 cm的管狀物，然后進行充分洗滌，除去添加劑，制得孔隙率為70%、孔徑為20～40 μm的中空纖維管(圖13)。用該方法制得的中空纖維管可用于周圍神經組織工程，但由于孔隙率和孔徑相對較小，在肌腱組織工程上的使用還需作深入研究。

圖13 中空纖維管狀織物

2.3 多元混構型支架

使組織工程支架能具有時空匹配性的另一種方法是從宏觀形態的組成結構入手，采用多元混構型可降解體系(DMBS)。DMBS支架可以定義為由可降解參數不同而幾何尺度(直徑、厚度)為1～100 μm的要素材料以特定方式排列形成的混合織構體系。要素材料的形態可以從長絲、短纖維，以及棒狀體、片狀體和扁條體等中選擇。

Liang等[30]研究了冷凍片狀脫細胞肌腱(DTSs)的力學性能和細胞黏附再生性。用核酸酶處理DTSs 12 h，測量其各項力學性能。DTSs拉伸強度、伸長率、拉伸模量和剛度分別達到正常肌腱的85.62%、123.61%、70.29%和93.07%；DTSs細胞外基質中超過93%的蛋白聚糖和生長因子被保存下來，并且DTSs促進了NIH-3T3型成纖維細胞的黏附和增殖。

3 問題與建議

3.1 面臨問題

目前關于用組織工程的方法修復肌腱的研究類文獻很多，很多學者認為組織工程技術將最終成為修復肌腱損傷的理想方法，但要想真正取得良好的臨床效果，還需要解決多方面的技術問題。主要包括支架材料的降解速率與細胞功能化如何保持同步，如何構造模擬人體三維張力環境，如何同時使支架具有良好的生物相容性和良好的體內力學性能等。

3.2 研究方向建議

就目前組織工程肌腱支架的研究狀況來看，短期內在支架材料上取得重大突破是非常困難的。建議今后可以開展以下幾個方面的研究工作：

(1)研制新型合成材料和改性天然材料，使其成為符合要求的較為理想的支架材料。這是肌腱組織工程研究的一個重要方向。

(2)可以開發具有一定識別功能和特定修復功能的智能支架材料。這將成為當前生物材料研究的前沿課題。

(3)可以對現有不同特性的材料在支架中的合理分布和揚長避短進行研究，為最終滿足支架同時具有良好生物相容性和力學性能提供一種可行途徑[16,31]。

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