非結核分枝桿菌2種培養方法和藥物敏感性試驗研究

王艷彬，吳海峰(.河北省血液中心檢驗科，河北 石家莊 05006；2.河北省胸科醫院檢驗科，河北 石家莊 05004)

·論著·

非結核分枝桿菌2種培養方法和藥物敏感性試驗研究

王艷彬1，吳海峰2*
(1.河北省血液中心檢驗科，河北 石家莊 050061；2.河北省胸科醫院檢驗科，河北 石家莊 050041)

目的探討BACTEC MGIT 960液體培養法和CLSI M24-A微量肉湯稀釋法快速藥敏試驗對非結核分枝桿菌的意義。方法分別采用BACTEC MGIT 960液體培養法聯合微量肉湯稀釋法的快速藥敏試驗與L-J固體培養法和絕對濃度藥敏法對48株非結核分枝桿菌進行培養，并對2種方法的培養時間和藥敏報告時間進行比較。結果48株非結核分枝桿菌在BACTEC MGIT 960培養儀的平均陽性報告時間(7.0±5.3)d，L-J培養基平均陽性報告時間(17.5±10.2)d，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。微量肉湯稀釋法結果陽性報告時間為7～14d，L-J固體藥敏試驗陽性報告時間為28d，2種藥敏試驗方法對相同種類藥物的耐藥率分析結果差異無統計學意義(P>0.05)，微量肉湯稀釋法比L-J法可以檢測的藥物種類更多。結論BACTEC MGIT 960液體培養法聯合微量肉湯稀釋法快速藥敏試驗比L-J固體培養法和絕對濃度藥敏法在培養時間、藥敏結果種類和報告時間上優勢明顯。

非結核分枝桿菌；微生物敏感性試驗；細菌學技術

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.07.020

分枝桿菌屬除了結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌外統稱為非結核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)，NTM在自然界中廣泛存在，屬于條件致病菌，目前已發現約160多種。NTM病具有與結核病臨床表現相似的全身中毒癥狀和局部組織損害，與結核病難以區分，但其治療卻與結核病有不同之處。2000年中華醫學會結核病學分會制定出《非結核分枝桿菌病診斷與處理指南》，2007年美國胸科協會(AmericanThoracicSociety,ATS)和美國傳染病學會(InfectiousDiseasesSocietyofAmerica,IDSA)也提出了NTM肺病的臨床和微生物學診斷標準，2種診斷標準大致相同，均提出NTM肺病的診斷主要依靠病原微生物學[1-2]。NTM菌種篩查和藥敏結果在流行病學上和臨床診斷、治療上都有重要意義[3]。本實驗采用BACTECMGIT960液體培養法聯合CLSIM24-A微量肉湯稀釋法的快速藥敏試驗與經典的L-J固體培養法和絕對濃度藥敏法作比較，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2012年1—12月在河北省胸科醫院就診的患者，采集痰、支氣管鏡灌洗液、膿標本進行分枝桿菌培養，剔除重復送檢患者，共分離出48株NTM。

1.2 標準菌株：結核分枝桿菌H37Rv、牛分枝桿菌購自生物制品研究所。

1.3 儀器、試劑：BACTECMGIT960培養儀，BBLpreparedculturemedia培養管均購自美國BD公司；快速藥敏試驗用肉湯購于上海積彩醫療器械有限公司公司;改良L-J培養基及藥敏培養基按《結核病診斷細菌學檢驗規程》[4]自制。

1.4 方法：快速藥敏試驗根據CLSIM24-A微量肉湯稀釋法，每種藥物選擇高低2個濃度，將藥物包被在96孔U型微量反應板上。濃度分別為鏈霉素(streptomyci，SM)2、8mg/L,異煙肼(isoniazid，INH)0.4、1.6mg/L，利福平(rifampicin，RFP)2、8mg/L，乙胺丁醇(ethambutol，EMB)4、16mg/L，氧氟沙星(ofloxacinforinjection，OFX)2、8mg/L，左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)2、8mg/L，阿米卡星(amikacin，AK)1、4mg/L，卷曲霉素(capreomycin,CM)2.5、10μg/mL，丙硫異煙胺(protionamide，1314Th)10、40mg/L，力克肺疾(isoniazidaminosalicylate，Dpc)0.5、2mg/L，莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)0.5、2mg/L，環丙沙星(ciprofloxacin，CPI)1、4mg/L，克拉霉素(clarithromycin，Clr)4、16mg/L，利福布丁(rifabutin,RFB)0.75、3mg/L，利奈唑胺(linezolid，Lz)2、8mg/L，加替沙星(gatifloxacin，Gfx)2、8mg/L。

L-J藥敏培養基按《結核病診斷細菌學檢驗規程》[4]每種藥物高低2個濃度。分別為SM10、100mg/L，INH1、10mg/L，RFP50、250mg/L，EMB5、50mg/L，Dpc1、10mg/L，LVFX2、20mg/L

1.5 菌型判定：用于菌型鑒定的C2-羧酸肼噻吩(TCH)100mg/L，對硝基苯甲酸(PNB)500mg/L。PNB-、TCH+為人型結核菌；PNB-、TCH-為牛型結核菌；PNB+、TCH+為NTM。

2 結 果

2.1 2種方法NTM陽性報告時間：48株NTM在BACTECMGIT960培養儀的陽性報告時間2～20d，平均(7.0±5.3)d；L-J培養基陽性報告時間7～52d，平均(17.5±10.2)d。2組差異有統計學意義(t=6.329，P<0.01)。

2.2NTM藥敏結果分析:在報告陽性后涂片抗酸染色確定為抗酸菌陽性，將培養物分別接種微量反應板和L-J藥敏培養基，7～14d后觀察微量反應板各孔的生長情況，進行菌型分型和獲得藥物MIC值。L-J常規藥敏試驗28d后根據生長狀況得到藥敏實驗結果。SM、INH、RFP、EMB、LVFX、Dpc這6種常用的抗結核藥物耐藥率均在90%以上，與L-J法檢出的耐藥率相差無幾，見表1。

微量肉湯稀釋法的快速藥敏試驗還可以對OFLX、AK、CM、1314Th、Mfx、CPI、Clr、RFB、Lz、Gfx10種藥物進行藥敏試驗 ，比L-J常規藥敏試驗所做的藥物種類多，藥物選擇的范圍大，臨床用藥指導意義更大。

表1 NTM 2種藥敏試驗結果Table 1 Two kinds of susceptibility testing for nontuberculous mycobacteria (n=48，n，%)

Sm:streptomyci； Inh：sonicotinic acid hydrazide；Rfp：rifampicin;Emb:ethambutol; Lfx :levofloxacin;Dpc:isoniazid aminosalicylate

3 討 論

NTM廣泛存在于自然界,大部分是腐物寄生菌，主要見于水、土壤和氣溶膠。NTM的疏水特性形成的生物膜使其可持續生存于供水系統中。人可從環境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的傳播途徑。與結核分枝桿菌比較，NTM毒力和致病性均較低，通常屬于機會性致病菌。NTM的易感者主要是慢性呼吸道疾病(慢性阻塞性肺疾病、肺結核殘余空洞、矽肺、支氣管擴張癥、肺囊性纖維化等)和免疫抑制者特別是獲得性免疫缺陷病患者，在獲得性免疫缺陷病和免疫受損宿主中，NTM通常表現為播散性。NTM病肺病的臨床特點因為與結核極其相似而極易發生誤診或漏診，因而對于反復慢性咳嗽咳痰，尤其是有支氣管擴張等慢性呼吸道疾病的患者，肺部出現上述病灶特點，應警惕NTM病感染的可能[2]。

近年來NTM所致疾病報道的增多，越來越引起臨床對分枝桿菌培養和NTM分離鑒定的重視。由于NTM對常用抗結核藥物普遍耐藥，傳統菌種鑒定方法根據菌株生長速度、色素產生、光反應、生化反應等進行分群，繁瑣費時，不利于指導臨床診斷[5]。因此，快速的菌型分型和藥敏試驗結果對NTM病的確診和治療方案的調整顯得尤為重要。

L-J培養和藥敏試驗法，NTM培養平均陽性報告時間為(17.5±10.2)d，最快陽性報告時間7d，最慢為52d，抗酸染色確定陽性后接種藥敏培養基大約需要4～8周才能得到藥敏結果。已經不能滿足臨床需求。因此，迫切需要一種簡單快速的培養、菌種初篩和藥敏試驗的方法，以幫助臨床制定合理有效的用藥方案。

利用BACTEC MGIT 960液體培養基進行分枝桿菌培養，非結核分枝桿菌平均陽性報告時間為(7.0±5.3)d，最快陽性報告時間為2d，最慢為20d。NTM在960培養管中不形成典型的條索狀生長，通過抗酸染色確定為抗酸菌陽性后，根據CLSI M24-A微量肉湯稀釋法原理，接種包被好的96孔U型微量反應板上，培養7～14d后即可得到菌種鑒定和藥敏試驗結果。

藥敏試驗藥物組合包括了常用的一線和二線抗結核藥物。有研究[6]顯示藥敏試驗結果統計NTM對常用的藥物SM、INH、RFP 3種藥物100%耐藥。另有研究[7]顯示NTM對EMB耐藥率90%以上，對Dpc、Ofx、Lfx、Pto、RFP耐藥率也達到90%以上，對Cip、Gfx、Mfx耐藥率達到70%以上。本研究48株NTM耐藥率非常高，可能與就診的患者大都經過其他醫院的治療或者有不規范的化療經歷有關。

目前國內對NTM的分型的檢驗技術尚未普及，核酸探針、PCR技術、基因芯片和細胞壁脂肪酸色譜分析等新技術尚未成熟用于臨床診斷，傳統的固體培養藥敏方法需要時間長，我們利用現有BACTEC MGIT 960液體快速培養法，結合CLSI M24-A微量肉湯稀釋法可以使NTM的菌型初篩和藥敏結果時間縮短到15～30d，有利于臨床根據菌種初篩及藥物敏感試驗結果，及時更改治療方案，減輕患者的痛苦和經濟負擔。

由于本研究樣本資料均來源于同一醫院，且樣本量不夠大，只能菌種初篩而不能準確分型，故研究結論尚需要大規模的實驗進行證實和完善。

[1] Chinese MedicaI Association of tuberculosis．Guidline on diagnosis and treatment of non tuberculous myeobacterial diseases[J].Chin J Tuberculosis Respir Dis，2000，23：650-653.

[2] GRIFFITH DE，AKSAMIT T，BROWN-ELLIOTT BA，et al.An official ATS/IDSA statement：diagnosis，teeatment，and prevention of nontuberculous mycobaeterial diseases[J].Am J Respir Crit Care Med，2007，175(4)：367-416.

[3] 吳龍章，李一耕，蔡杏珊，等.同時從痰液、胸腔積液分離出鳥分枝桿菌1例[J].中華結核和呼吸雜志，2000，23(10)：601.

[4] 中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程[J].中國防癆雜志，1996，18(1)：28-31.

[5] 梁建琴，吳雪瓊，張俊仙，等.應用聚合酶鏈反應-膜芯片技術快速鑒定分枝桿菌菌種[J].河北醫科大學學報，2004,25(5)：289-291.

[6] FUJITA Y,LSHII S,HIRANO S,et al.A case of lung cancer complicatedwith active non-tuberculous mycobacterium(NTM) infection successfully treated with anti-cancer agents and anti-NTM agents[J].Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi,2011,49(11)：855-860.

[7] 史祥，尹洪云.58例非結核分枝桿菌肺病住院患者的臨床分析[J].臨床肺科雜志，2013,18(2)：311-312.

(本文編輯：劉斯靜)

TWOSETSOFNON-TUBERCULOUSMYCOBACTERIUMCULTUREMETHODANDDRUGSENSITIVITYTESTSTUDY

WANGYanbin1，WUHaifeng2*
(1.ClinicalLaboratory，BloodCenterofHebeiProvince,Shijiazhuang050061,China2.ClinicalLaboratory，ChestHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050041,China)

CT:ObjectiveTostudytheBACTECMGIT960liquidculturemethodandtheCLSIM24-Abrothmicrodilutionmethodforrapidsusceptibilitytestingthesignificanceofnon-tuberculousmycobacteria.MethodsTheBACTECMGIT960liquidculturebrothmicrodilutionmethodcombinedrapidsusceptibilitytesting,andL-Jsolidculturemethodcombinedtheabsoluteconcentrationsusceptibilitymethodwererespectivelyusedin48strainswithnontuberculousmycobacteri,theculturetimeandsensitivityreportingperiodoftwocombinationmethodswerecompared.ResultsTheaveragepositivereporttimein48strainsofnontuberculousmycobacteriaculturewithBACTECMGIT960instrumentwas(7.0±5.3)d,whilethatofL-Jmediawas(17.5±10.2)d,incomparisontheresultsoftwomethodsweresignificantlydifferent(P<0.05),thereportedtimeofbrothmicrodilutionFranceresultswas7-14d,thereporttimeofL-Jsolidsusceptibilitytestwas28d,thecomparisonshowedsignificantdifference,twokindsofsusceptibilitytestingmethodsforthesametypeofdrugresistancerateanalysisshowednosignificantdifference(P>0.05),brothmicrodilutionmethodcandetectmoretypesofdrugsthantheL-Jmethod.ConclusionBACTECMGIT960liquidculturebrothmicrodilutionmethodcombinedrapidsusceptibilitytestinghasobviousadvantagesoverL-Jsolidculturemethodandtheabsoluteconcentrationsusceptibilitymethodintheincubationtimeandsusceptibilityresultsreportingtimetypes.

nontuberculousmycobacteria；microbialsensitivitytests；bacteriologicaltechniques

2013-10-22；

2013-12-30

河北省醫學科學研究重點課題計劃(20100208)

王艷彬(1978-)，男，河北藁城人，河北省血液中心主管檢驗師，醫學學士，從事病毒學檢驗研究。

*通訊作者。E-mail：haifengwu77@163.com

R378.91

A

1007-3205(2014)07-0797-04