抑制KIF14表達可增加肝癌細胞對紫杉醇敏感性

李曉娜，韓 雪，楊 濤，王紅磊，高鵬志，趙 瑋(.河北省體育科學研究所普通外科，河北 石家莊 0500；.河北省石家莊市第一醫院普通外科，河北 石家莊 0500)

·論著·

抑制KIF14表達可增加肝癌細胞對紫杉醇敏感性

李曉娜1，韓 雪1，楊 濤2，王紅磊2，高鵬志2，趙 瑋2
(1.河北省體育科學研究所普通外科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫院普通外科，河北 石家莊 050011)

目的通過抑制肝癌細胞中KIF14表達，觀察紫杉醇對肝癌細胞增殖的影響。方法應用RNA干擾技術，肝癌細胞中沉默KIF14表達，在經紫杉醇處理細胞后采用MTT試驗檢測肝癌細胞增殖能力的變化。結果肝癌細胞中沉默KIF14的表達可以增強其對紫杉醇的敏感性。結論KIF14在肝癌細胞耐藥發生過程中發揮著重要作用，進一步研究其作用機制可以為尋找克服肝癌耐藥的有效途徑提供理論依據。

肝腫瘤；驅動蛋白；抗腫瘤藥

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.007

肝細胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其中43.7%的病例發生在我國，嚴重威脅著我國人民的生命健康[1]。目前，針對HCC的治療，仍以手術為首選，然而HCC放療不敏感及其對化療藥物的強耐藥性，導致HCC患者術后復發率高，轉移快[1]。有研究[2]表明，腫瘤年病死率中與腫瘤耐藥相關的占90%以上。紫杉醇在腫瘤化療中已被廣泛應用，在多數腫瘤的臨床治療中取得了良好的效果，并得到臨床醫生的認可[3]，但是由于HCC的強耐藥性，使紫杉醇在HCC治療中的效果不令人滿意。腫瘤耐藥是一個多因素參與、多基因異常表達的復雜過程，驅動蛋白家族成員KIF14是以細胞內微管為軌道的動力蛋白[4-5]，KIF14在HCC組織中異常過表達，并可能參與了HCC的耐藥過程。本研究通過抑制肝癌細胞中KIF14表達，觀察紫杉醇對肝癌細胞增殖的影響，旨在揭示KIF14在肝癌耐藥發生過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料:人肝癌細胞株HepG2和SMMC7721購自中國科學院上海細胞所。DMEM高糖培養基和胎牛血清購自美國Invitrogen公司，紫杉醇購自江蘇恒瑞制藥有限公司。MTT試劑購自北京鼎國生物技術有限公司，pGCsiU6/Neo/GFP載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司(Genechem)。

1.2 肝癌細胞培養：人肝癌細胞株HepG2和SMMC7721正常傳代，常規置于10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合的DMEM培養基中，37℃,5%CO2加濕空氣培養。

1.3 轉染細胞穩定細胞株建立：通過在pGCsiU6/Neo/GFP質粒序列載體(Genechem)中插入合成雙鏈寡居核苷酸(KIF14:5′TTCCCGATCTCATTCAGTT-TTTTCAAGAGAAAACTGAATGAGATCGGGAA或非沉默:5′TTCTCCGAACGTTTCTATCTTTTCAAGAGAAGATAGAAACGTTCGGAGAA3′)建立小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)表達載體。采用陽離子脂質體轉染法，根據Lipofectamine-2000試劑要求進行，用熒光標記梯度濃度的siRNA轉染至肝癌細胞株SMMC-7721和HepG2，轉染后置37℃ 5%CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養10h后，更換培養液繼續培養72h，加入濃度為800mg/L的G418(Calbiochem)進行篩選，得到4個穩定表達的HepG2和SMMC-7721細胞系繼續培養，同時培養陰性對照組。

1.4 不同濃度紫杉醇處理后肝癌細胞增殖變化：分別選擇對數生長期的HepG2和SMMC-7721細胞及沉默KIF14的HepG2和SMMC-7721細胞，常規消化后，于96孔板中每孔加入1×104個細胞，實驗組每孔分別加入100μL含紫杉醇3、6、12、24、48mg/L的培養液。細胞對照組每孔分別加入不含紫杉醇的培養液100μL，空白對照組每孔分別加入不含細胞的等體積培養液。每個濃度設3個復孔，置37℃,5%CO2加濕空氣培養。48h后每孔加入濃度為5g/L的MTT溶液20μL，繼續培養4h，棄培養上清液，每孔加入二甲亞砜(dimethysulfoxide,DMSO)100μL，充分振蕩后酶標儀測量各孔吸光度值(OD570)。依據下面的公式計算細胞的抑制率(inhibitionratio,IR)=(細胞對照組OD570-實驗組OD570)/(細胞對照組OD570-空白對照組OD570)×100%，并根據藥物濃度繪制抑制率曲線。

1.5 沉默KIF14表達的操作：應用哺乳動物載體介導的RNA干擾切除肝癌細胞鏈中KIF14的表達的HepG2和SMMC-7721細胞株。將KIF14基因編碼區的一對寡核苷酸靶向1 701～1 721bp合成并插入pGCsiU6/Neo/GFPsiRNA表達載體。肝癌細胞帶著KIF14siRNA表達或控制載體轉染。G418篩選后，獲得穩定的轉染細胞系。

2 結 果

應用MTT法檢測各轉染細胞及其相應的親本細胞耐藥性，與親本細胞株相比，各轉染細胞株在不同濃度的紫杉醇作用下，細胞抑制率均明顯升高(P<0.01)。見表1，2。

GroupsPaclitaxelconcentrations3μmol/L6μmol/L12μmol/L24μmol/L48μmol/LHepG210．87±1．2025．04±2．0640．21±1．6762．26±1．4271．29±1．58HepG2/siRNA20．87±2．1045．30±2．5770．33±2．5290．28±1．7096．08±1．87 t19．02064．66061．636172．998118．965 P0．0030．0000．0000．0000．000

Groups Paclitaxelconcentrations3μmol/L6μmol/L12μmol/L24μmol/L48μmol/LSMMC?772110．34±1．4926．99±2．0142．24±1．6561．73±1．6170．35±1．84SMMC?7721/siRNA27．23±1．5648．66±1．5372．09±1．8682．99±2．0296．96±2．05 t61．63664．684205．82177．271114．955 P0．0000．0000．0000．0000．000

3 討 論

驅動蛋白是以細胞內微管為軌道的動力蛋白。此類蛋白在許多細胞進程，如mRNA和蛋白質細胞內運輸、細胞有絲分裂、信號傳導、減數分裂、微管多聚體的運動學控制中起重要作用[4-5]。驅動蛋白家族成員KIF14是具有6 586個堿基對的10cDNA克隆[6]。像所有驅動蛋白一樣，KIF14是微管依賴分子馬達，包括一個驅動蛋白域和一個叉頭關聯域[7]，同時KIF14還包含C端香木緣激酶綁定域和N端蛋白調節胞質分裂綁定域，使KIF14在胞質分裂、HeLa細胞中KIF14枯竭致雙核細胞生成和細胞凋亡中扮演重要角色[8-9]。

KIF14在一些腫瘤發生、發展的過程中起著重要作用[7,10]，并且可能參與了腫瘤對化療藥物耐藥的發生過程。為了解并分析KIF14在肝癌細胞對紫杉醇耐藥過程中的作用，我們選取肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721進行研究，首先應用siRNA干擾技術，沉默肝癌細胞株中KIF14的表達，通過MTT的方法檢測肝癌細胞對紫杉醇的敏感性，結果發現沉默KIF14的表達可明顯增加肝癌細胞對紫杉醇的敏感性。提示KIF14可以增加肝癌細胞對紫杉醇的耐藥性。

總之，本研究選取2株肝癌細胞株進行實驗，通過siRNA干擾技術，建立穩定的沉默KIF14的肝癌細胞系，應用MTT實驗證實KIF14在肝癌細胞對紫杉醇耐藥過程中發揮著重要作用。那么，KIF14的具體作用機制是什么？是否還有其他機制共同參與了肝癌細胞對紫杉醇的耐藥過程？這將是我們繼續研究的目標。這些研究完成后將可以系統地闡述肝癌細胞對紫杉醇耐藥的分子機制，從而使逆轉腫瘤耐藥成為可能，最終能使化療明顯延長術后腫瘤患者及晚期腫瘤患者的存活期。

[1] 楊濤,孫軼飛,王立偉,等.KIF14過表達與肝細胞肝癌手術預后密切相關[J].河北醫科大學學報,2014,35(3):263-265.

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(本文編輯：許卓文)

INHIBITINGKIF14EXPRESSIONINCREASESSENSITIVITYOFHEPATOCELLULARCARCINOMATOPACLITAXEL

LIXiaona1,HANXue1,YANGTao2,WANGHonglei2，GAOPengzhi2，ZHAOWei2
(1.DepartmentofGeneralSurgery,theSportsScienceInstituteofHebeiProvince,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofGeneralSurgery,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveThisstudyobservestheeffectofpaclitaxelonlivercancercellproliferationbyinhibitingKIF14expressioninlivercancercells.MethodsSilencedKIF14expressioninlivercancercellsbyRNAinterference,thesecellsweredeltbypaclitaxelandtheproliferationabilityoflivercancercellswasdeterminedbyMTTtest.ResultsSilenceKIF14expressioninlivercancercellsenhancedthecellssensitivitytopaclitaxel.ConclusionKIF14isimportantintheprocessofdrugresistanceproducedbyhumanhepatocellularcarcinomacells.Furtherstudyonitsmechanismcanprovidetheoreticalbasisforseekingtheeffectivewaystoovercomedrugresistanceoflivercancer.

liverneoplasms；kinesin；antineoplasticagents

2014-04-02；

2014-05-16

河北省科學技術研究與發展計劃項目(132777236)

李曉娜(1979-) 女，滿族，吉林吉林人，河北省體育科學研究所主治醫師，醫學碩士，從事普通外科疾病診治研究。

R735.7

A

1007-3205(2014)08-0886-03