器官特異性轉移肺癌細胞株的篩選及建立

周清華 祖玲玲 李潞 陳曉禾 陳曉峰 李洋 劉紅雨 孫芝琳

肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。肺癌是男性死亡率和發病率均為首位，女性發病率第二位，死亡率第一位的腫瘤[1-7]。近30年來，全世界肺癌發病率和死亡率不斷增長，但總的治愈率卻沒有明顯提高，5年生存率低于15%[1,8-14]。肺癌高死亡率的主要原因是大約50%的患者就診時已有遠處轉移，30%-40%的患者在治療過程中發生遠處轉移[15-18]。肺癌轉移是肺癌的惡性標志和生物學特征，也是導致治療失敗和死亡的最主要原因[2-7]。肺癌轉移是一個有多基因參與調控、涉及多信號通路、多階段、多步奏發生的復雜過程[7,9]。已有的研究證明：體外培養和建立人肺癌細胞系對于研究肺癌癌變、侵襲轉移、多藥耐藥的分子機理、生物學特征，以及開發抗肺癌新藥等均有十分重要的理論和臨床意義[8,14-18]。研究肺癌轉移的有效方法是利用具有相同遺傳背景、不同轉移潛能、基因和信號調節途徑的肺癌細胞株作為天然對比材料[8]。等經過多年對腫瘤轉移機制的研究，人們認識到腫瘤細胞異質性與腫瘤轉移密切相關，其理論核心是：腫瘤本質上是由多克隆異質性細胞所組成，轉移之所以發生，主要是由于具有高轉移能力的克隆株細胞存在于腫瘤細胞群體之中。已有的研究[19-29]證明：肺癌與其他腫瘤一樣其遠處轉移具有器官特異性選擇。目前，國內外已經構建了前例腺癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌器官特異性轉移細胞株[19-29]，但迄今國內外均無有關肺癌器官特異性轉移肺癌細胞株的報道。為了篩選鑒定和建立具有器官特異性轉移的人肺癌細胞株，我們應有我們實驗室獨有的人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981為材料，通過體內外篩選以期篩選出具有靶向器官特異性侵襲轉移潛能的肺癌細胞株，為進一步的研究肺癌靶向器官特異轉移提供科學可靠的細胞模型。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器 ①母系高轉移肺癌細胞株：L9981-Luc。L9981-Luc是應用本實驗篩選的人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981，轉染Luciferanse ，篩選鑒定后，細胞株穩定表達Luciferanse的人高轉移大細胞肺癌細胞株。②細胞培養基：RPMI-1640。③細胞培養基：購自美國Sigma公司。④精制小牛血清：購自美國Gibico公司。⑤胰蛋白酶：購自Amresco公司。⑥原代細胞培養基：購自美國JIBICO公司⑦動物活體成像儀：IVIS200型，購自美國精若真公司。⑧倒置熒光相差顯微鏡：尼康TE-2000型，購自日本尼康公司。

1.2 主要研究方法 從液氮罐取出L9981-Luc細胞株，復蘇后，常規培養，等到細胞株貼壁生長良好后，將1×105母系肺癌細胞株L9981-Luc接種到裸鼠皮下腹股溝皮下，每周一次應用動物活體成像儀對荷裸鼠進行活體成像，觀察母系肺癌細胞株L9981-Luc在裸鼠體內的成瘤性和遠處轉移情況。當活體成像觀察到母系肺癌細胞株L9981-Luc在遠處形轉移瘤后，處死裸鼠，在無菌情況下解剖出裸鼠的肺癌轉移器官（肺、大腦、脊柱和縱隔淋巴結），并子無菌條件下解剖出相應的肺癌器官特異性瘤結節。在無菌條件下，在培養基中將相應的肺癌器官特異性瘤結節切成細碎片，并進行器官特異性轉移的原代培養。當原代培養的器官特異性轉移肺癌細胞株貼壁生長良好后，將大部分原代培養器官特異性轉移肺癌細胞株在液氮中凍存，將1×105原代培養器官特異性轉移肺癌細胞株分別接種到裸鼠皮下腹股溝皮下，每周一次應用動物活體成像儀對荷裸鼠進行活體成像，觀察原代培養器官特異性轉移肺癌細胞株在裸鼠體內的成瘤性和遠處轉移情況。當活體成像觀察到在原代培養的器官特異性轉移肺癌細胞株在遠處形成轉移瘤后，處死裸鼠，在無菌情況下解剖出裸鼠的肺癌轉移器官（肺、大腦、脊柱和縱隔淋巴結），并子無菌條件下解剖出相應的肺癌器官特異性瘤結節。在無菌條件下，在培養基中將相應的肺癌器官特異性瘤結節切成細碎片，并進行器官特異性轉移的原代培養。經過如此反復的蔣器官特異性轉移原代肺癌細胞株進行體內外篩選后，篩選建立成功4株人器官特異性轉移肺癌細胞株（篩選流程見圖1）。

圖1 高器官靶向特異性轉移潛能肺癌細胞株篩選流程圖Fig 1 Work flow of screening human lung cancer cell lines with high tissue-specific metastasis potential

2 結果

2.1 器官特異性轉移肺癌細胞株成瘤性及器官靶向轉移率比較 母系肺癌細胞株L9981-Luc為對照，4株器官特異性轉移肺癌細胞株（L9981-LuM, L9981-LnM, L9981-BrM,L9981-BoM）為實驗組，分別接種裸鼠，評估器官特異性轉移在裸鼠體內性成瘤率和器官特異性轉移百分比。每組5只裸鼠作為獨立的實驗，接種對照組和實驗組細胞株后每周進行裸鼠活體成像，8周后解剖取得肺，淋巴，脊柱，腦組織，并解剖出器官特異性轉移的轉移瘤，活體成像儀分析。結果 發現對照組中的5只小鼠的肺，淋巴，脊柱，腦均發生了肺癌轉移，轉移百分比均為100%。而實驗組L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM、L9981-BoM細胞株，均具有器官特異性轉移，但沒有發生其他器官轉移。L9981-LuM細胞株全部轉移到肺，5只裸鼠均發生了肺轉移瘤，轉移百分比均為100%，而縱隔淋巴結，脊柱，大腦均沒有發生肺癌轉移。L9981-LnM細胞株全部轉移到縱隔淋巴結，5只裸鼠中均發生了縱隔淋巴結轉移，而肺、脊柱和大腦均為發現有肺癌轉移。L9981-BrM細胞株全部轉移到大腦，5只裸鼠均發生了大腦轉移，而肺、淋巴結和骨均未發現有肺癌轉移。L9981-BoM細胞株接種裸鼠后5只裸鼠全部發生了脊柱轉移，而肺、淋巴結、和大腦均未發現肺癌轉移（圖2，表1）。

圖2 第一代原代器官特異性轉移肺癌細胞株轉移器官活體成像成像Fig 2 The living imaging of metastasized organs planted with the first generation of organ-specific metastasis lung cancer cell line

表 1 母系肺癌細胞株與4株器官特異性轉移肺癌細胞株成瘤性及器官特異性轉移率比較Tab 1 comparison of tumorigenicity and organ-specific metastasis ability between the parent lung can cell line L9981 and the 4 organ-specific metastasis cell lines

2.2 器官特異性轉移肺癌細胞株細胞形態學 培養篩選所得人肺癌器官特異性轉移潛能細胞株，分別通過100×、200×、40×顯微觀察其形態，與對照組細胞比較，形態均發生了不同程度的改變，其中L9981-BoM、L9981-BrM、L9981-LnM三株細胞株形態較之L9981-luc的不規則梭形均變化呈不同程度的圓形形態（圖3）。

2.3 人肺癌器官特異性轉移細胞株轉移裸鼠體內轉移的活體成像結果 通過裸鼠腹股溝皮下種植篩選獲得的具有靶向器官特異性轉移潛能細胞，此后分別在1周、3周、6周活體成像分析其體內轉移能力，發現所檢測腫瘤細胞在體內普遍成瘤且發生了轉移，活體成像觀察的原位癌信號強弱與體內生長時間呈正相關，體內轉移灶腫瘤細胞信號強弱同樣與時間呈正相關（圖4）。

3 討論

肺癌轉移是肺癌的惡性標志和的重要生物學特征，且是造成癌癥患者死亡的首要因素[2-6]。腫瘤的轉移是由多因素參與、多基因調控，腫瘤細胞與靶器官相互作用的多階段復雜過程[7-10]。每個組織、器官都有自身的結構及微環境特點，腫瘤細胞侵入靶器官就必須應對環境的壓力，包括：氧氣和營養的缺乏、低pH、活性氧自由基和炎癥反應調節因子，經過環境的選擇后，腫瘤細胞形成新的癌灶[12-20]。

圖3 母系與器官特異性轉移肺癌細胞株形態學比較Fig 3 Comparison of morphology among the parent lung cancer cells and the organ-specific metastasis cells

腫瘤器官轉移具有器官特異性的，不同類型腫瘤的轉移對不同靶器官的親和力往往不同，存在屬于其自身的特點。前列腺癌最最常見的轉移部位是骨，肝癌最常見的轉移器官為肺；乳腺癌常轉移到肺、骨和大腦；肺癌常轉移到大腦、淋巴結、骨、肝臟和腎上腺。目前，肺癌是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌引發高死亡率原因主要是因為肺癌發生了其它器官的轉移，比如腦、骨、脊柱、淋巴等。因此，深入研究肺癌器轉特異性轉移的分子機理及信號調節途徑，極有可能為肺癌轉移的預測、早期診斷和開發抑制/或逆轉的分子靶向藥物具有重要的理論意義和廣闊的臨床應用前景。然而，要研究肺癌器官特異性轉移分子機制的最可靠方法是必須應用具有相同遺傳背景、不同器官特異性轉移的天然對比細胞株。正是基于上述科學問題，我們應用我們實驗室的人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981為母系細胞株作研究材料，經體內外篩選，以期建立具有器官特異性轉移的肺癌細胞株。

圖4 器官特異性轉移肺癌細胞株裸鼠活體成像Fig 4 The Living Imaging of the nude mice planted with organ-specific metastasis lung cancer cells

目前，國內外已經建立了多種人器官特異性轉移惡性腫瘤細胞株[22-29]。但是，迄今為止有關肺癌器官特異性轉移肺癌細胞株的篩選鑒定的研究國內外均無報道。因此，本課題組應用我們實驗室建立的人高轉移大細胞肺癌細胞株為材料，通過體內外的篩選鑒定，成功篩選建立了一個能特異性轉移到肺、縱隔淋巴結、骨和大腦的器官特異性轉移肺癌細胞模型，并將特異性轉移到肺，淋巴，腦，脊柱的器官特異性轉移肺癌細胞株，分別命名為L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM。隨后，我們應用裸鼠肺癌自發轉移動物模型，活體成像技術和病理學技術對L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM的器官特異性轉移潛能進行了驗證。我們的研究結果證明：與母系肺癌細胞株L9981比較，L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM肺癌細胞株除均能在裸鼠體內均成瘤外，還能特異性地轉移到肺、淋巴結、大腦和骨，而L998細胞株則除了能在裸鼠體內成瘤外，還能百分之百地轉移到肺、淋巴結、大腦和骨。此外，通過顯微觀察，4株器官特異性轉移肺癌細胞株（L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM）與母系細胞株L9981比較，其形態學發生了顯著改變，呈不規則圓形或橢圓型形態。我們推測，這一形態的變化可能是肺癌細胞在發生轉移過程中，為了適應轉移靶器官的微環境，并在靶器官形成新的癌灶，以便存活生長而發生的表型變化，但是其分子機制和細胞信號調控途徑尚未完全明了，有待以后進行更深入的研究。