99mTc標記T7肽及其在裸鼠非小細胞肺癌模型體內的生物分布研究

郝玉美 賀欣 周曉靚 孟愛民 劉鑒峰 劉金劍 宋娜玲

肺癌是一種臨床常見疾病，80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），其發(fā)病率和死亡率已躍居惡性腫瘤首位，5年內生存率極低，肺癌的早期診斷對于降低肺癌患者死亡率和提高患者的存活時間極為關鍵[1]。目前在肺癌早期顯像領域，18F-FDG PET/CT顯像雖然取得了一定的臨床效果，但由于其存在一定的假陽性率和假陰性率，PET/CT對于腫瘤的應用前景仍有賴于新型特異性更高的顯像劑開發(fā)。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤新生血管內皮細胞及某些腫瘤細胞表面高表達整合素αvβ3，而已存在的血管和正常組織中并不表達或表達量很低，整合素αvβ3可作為腫瘤新生血管的重要標志物[2]，由于腫瘤組織新生血管豐富，整合素αvβ3成為了腫瘤診斷和治療的有力靶點[3]，近年來關于αvβ3受體靶向診斷和治療方面的研究已有許多報道[4-6]。腫瘤抑素（Tumstatin）是繼內皮抑素（Endostatin）和血管生成抑素（Angiostatin）之后，源于人血管基膜IV型膠原蛋白α3鏈的腫瘤抑制因子，能夠以RGD非依賴方式結合于整合素αvβ3，抗腫瘤活性區(qū)定位于T7片段區(qū)。本研究所采用的T7肽即是來源于腫瘤抑素IV型膠原蛋白的25肽，可通過RGD非依賴模式與整合素αvβ3特異結合并抑制腫瘤新生血管生成[7]。本研究旨在探討將其用作肺癌靶向顯像探針的可能性。T7分子量小，免疫原性低，結合位點明確，是一個非常有潛力的活性探針[8]。本研究采用羰基锝法標記T7肽，研究99mTc-T7在荷人NSCLC（NCI-H157）裸鼠腫瘤模型體內的生物分布，探討99mTc-T7用作肺癌顯像劑的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料 NCI-H157人NSCLC細胞購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫；BALB/c裸鼠25只（7 g-19 g），4周-6周齡，雄性，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所；T7肽（TMP FLFCNVNDVCNFASRNDYSKKK），分子量2,942.41，純度96.84%，委托北京亞美多肽生物科技有限公司合成；硼氫化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、HCl、丙酮由天津江天化工公司提供；高锝酸溶液（99mTcO4-）由北京原子高科股份有限公司提供；SN-6100型全自動放射免疫γ計數(shù)器（上海核所日環(huán)光電儀器有限公司）；薄層掃描儀AR-2000（BioScan）。

1.2 方法

1.2.199mTc-T7的標記 羰基锝法標記多肽反應式見圖1。本研究通過計算機分子模擬手段分析T7與整合素αvβ3受體的結合特異性并將其結合活性位點定位于Ser90、Arg91、Asp93和Tyr94[9]，為改善T7肽水溶性，在不改變其活性和結合位點的前提下，將T7序列N端三個疏水氨基酸改為賴氨酸（Lys, K），分子量2,942.41，純度96.84%，序列為TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYS KKK。精確稱量硼氫化鈉20 mg、碳酸鈉4 mg、酒石酸鉀鈉15 mg，裝入一個西林瓶中，密封后通入CO氣體30 min，將瓶內空氣排空壓好鋁蓋后備用。將2.5 mL99mTcO4-生理鹽水淋洗液（74mBq，可根據(jù)實驗需要調整活度與體積），用注射器注入西林瓶中，通入CO氣體，80oC水浴反應15 min。反應結束后，西林瓶冷卻至室溫，加入1 M HCl調節(jié)pH至中性。將新鮮制備的99mTc(CO)3+加入T7肽溶液中，50oC反應90 min。取出自然冷卻至室溫備用。

1.2.299mTc-T7的放化純與穩(wěn)定性檢測 薄層色譜法檢測標記率及放化純度，以硅膠板為固定相，丙酮作為展開系統(tǒng)，毛細管點樣，放射性γ計數(shù)器進行檢測。穩(wěn)定性檢測：取500 μL的99mTc-T7溶液分別加入1 mL的生理鹽水和1 mL人血清中，37oC孵育8 h，用薄層色譜法檢測放化純度。

1.2.399mTc-T7與NCI-H157細胞親和力測定 根據(jù)放射性配體受體結合測定方法來測定放射性配體99mTc-T7與NCI-H157細胞表面整合素αvβ3受體的親和力，本研究采用6濃度4孔平行實驗。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)NCI-H157細胞，并將其按照20,000個/500 μL/孔鋪2塊24孔板，分別為總結合板和非特異性結合板（總結合代表99mTc-T7與反應體系中所有可結合位點的結合；非特異性結合代表99mTc-T7與整合素αvβ3之外的位點結合），培養(yǎng)過夜待用。將非特異性結合板的培養(yǎng)液棄去，500 μL冷PBS洗兩次，加入200 μL未標記的80 mM T7液進行飽和，冰上孵育1 h。將99mTc-T7配制成如下濃度：5 nM、10 nM、20 nM、40 nM、80 nM、160 nM；將總結合板和非特異性結合板內的培養(yǎng)液或冷物質均棄去，500 μL冷PBS洗2次，對應加入6個濃度的99mTc-T7溶液，每個濃度設4個平行孔，冰上孵育1 h，將溶液棄去，500 μL冷PBS洗2次，加入1 mL 1 M NaOH消化，室溫反應1 h，轉移到計數(shù)管內，測量各孔的放射性計數(shù)，總結合計數(shù)與非特異性結合計數(shù)的差值即為特異性計數(shù)。數(shù)據(jù)處理，繪制放射性受體配體結合飽和曲線和Scatchard圖，得到解離常數(shù)KD值。

圖1 羰基锝法標記多肽反應式。R1、R2、R3代表來自于多肽游離氨基殘基的-NH2或者-SH。Fig1 The equation of carbonyl technetium labeling polypeptide. R1, R2, R3 represens the -NH2 and -SH comes from the polypeptide amino free residues.

1.2.4 荷人NCI-H157裸鼠肺癌模型構建 將NCI-H157細胞株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2次，0.25%胰酶消化，收集細胞，離心，生理鹽水重懸并計數(shù)。無菌條件下，每只裸鼠右后肢背部皮下注射6×106個/200 μL的NCI-H157細胞懸液。裸鼠置于天津市實驗動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)，當腫瘤長徑達0.6 cm-1.0 cm時進行實驗（約30 d）。

1.2.599mTc-T7在荷人NCI-H157裸鼠體內的生物分布測定將荷瘤裸鼠隨機分成5組（0.5 h、1 h、2 h、4 h和8 h），每組5只，分別尾靜脈注射3.7 MBq/100 μL的99mTc-T7溶液，注射后分別在0.5 h、1 h、2 h、4 h和8 h股動脈放血處死，分別取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨骼、腦、腫瘤、小腸、胃，稱濕重，測量γ計數(shù)，計算各臟器的每克組織注射劑量百分比（%ID/g）并分析腫瘤/非腫瘤（T/NT）比值。

2 結果

2.199mTc-T7的制備及質控99mTc-T7制備后，用薄層色譜法測得高锝酸溶液的放化純?yōu)?8%，99mTc-T7的放化純?yōu)?2.1%，見圖2。99mTc-T7在37oC生理鹽水和37oC人血清中放置8 h后，放化純均仍高于90%，見圖3。結果 表明99mTc-T7標記率高且具有較好的穩(wěn)定性。

2.299mTc-T7與NCI-H157細胞的平衡解離常數(shù)分析 在放射性配基濃度99mTc-T7足夠大的情況下，受體整合素αvβ3全部被其結合，這時的放射性配基99mTc-T7的結合量即反映出受點含量，我們將其稱為最大結合量，以Bmax表示。若以B代表與受體整合素αvβ3結合的配基量，F(xiàn)代表配基99mTc-T7的濃度，KD代表解離常數(shù)。根據(jù)Clark受體理論：B＝Bmax·F/(F+KD)，B與F作用是一條直角雙曲線，將B＝Bmax·F/(F+KD)變形得：B/F＝Bmax/KD-B/KD，以B/F為縱坐標，B為橫坐標，即為Scatchard作圖，線性回歸，斜率m=1/KD[10]。

99mTc-T7與NCI-H157細胞的結合飽和曲線見圖4，Scatchard作圖法分析結果見圖5。99mTc-T7與NCI-H157細胞的KD值為131.6 nM。

2.399mTc-T7在裸鼠肺癌模型體內的生物分布 裸鼠肺癌模型注射99mTc-T7后，從0.5 h-8 h內均顯示出較高的腫瘤攝取，從注射后2 h-8 h腫瘤的放射性攝取均高于肌肉、骨骼、腦、小腸、胃等組織，見表1和圖6。腫瘤/肌肉的T/NT比值隨著時間延長而增加，能達到5以上，且在4 h-8 h之間取值較為理想，見圖7。此外，標記物在肺組織內存在一過性聚集，肺組織放射性強度在注射2 h后逐漸降低，見圖6，有必要進一步研究99mTc-T7在肺部腫瘤的滯留性質，研究其在原位肺癌模型中的生物分布特征，探索其應用前景。腦放射性始終呈低水平，見圖6，表明99mTc-T7不能正常通過血腦屏障，有可能用于評價血腦屏障的完整性，且要進行腦部腫瘤顯像尚需對T7肽的結構進一步改造。據(jù)表1中數(shù)據(jù)可見，99mTc-T7在肺部和血液中的放射性水平明顯高于腫瘤，該顯像劑仍存在本底高這一普遍性問題，尚需對T7肽進行更深一步的改造，如引入雙功能螯合劑（DTPA、DOTA、HYNIC及葡聚糖等），來加速組織本底放射性的降低，提高顯像圖像質量。注射99mTc-T7后，肝、脾的放射性較高，腎臟次之，表明此標記物主要通過肝脾代謝，泌尿系統(tǒng)次之，且隨時間延長血液的放射性攝取值（%ID/g）降低較快，8 h時血的放射性攝取值（%ID/g）可降為0.5 h時的26%，表明99mTc-T7血液清除較快。

圖 2 99mTc-T7薄層色譜掃描圖。A：高锝酸溶液，放化純98%；B：99mTc-T7，放化純92.1%。Fig 2 99mTc-T7 thin layer chromatography scan. A: high technetium acid solution, radiochemical purity 98%; B: 99mTc-T7, radiochemical purity 92.1%.

圖 3 99mTc-T7體外穩(wěn)定性檢測。A：99mTc-T7在37 oC生理鹽水8 h后，放化純＞90%；B：99mTc-T7在37 oC人血清8 h后，放化純＞90%。Fig 3 99mTc-T7 stability tests in vitro. A: 99mTc-T7 with high radiochemical purity over 90% after 8 h at 37 oC saline water; B: 99mTc-T7 with high radiochemical purity over 90% after 8 h at 37 oC human serum.

圖 4 99mTc-T7與NCI-H157細胞的親和力測定，飽和曲線圖Fig 4 Affinity determination of 99mTc-T7 and NCI-H157, Saturation curve graphs

圖 5 99mTc-T7與NCI-H157細胞的親和力測定，Scatchard作圖Fig 5 Affinity determination of 99mTc-T7 and NCI-H157, Scatchard plot

表 1 99mTc-T7在NCI-H157裸鼠模型體內生物分布（%ID/g±SD）（n=5）Tab 1 The biodistribution of 99mTc-T7 in nude mice model (%ID/g±SD)( n=5)

3 討論

肺癌已位居世界癌癥死亡率的首位，其早期診斷對降低肺癌的死亡率和提高患者存活時間至關重要，早期肺癌手術切除后的5年生存率可達到67%-80%以上。目前臨床常用的檢查手段主要有：胸部CT、纖維支氣管鏡檢查、血清學檢查等[11]，但都存在一定的局限性，大多數(shù)患者在診斷出肺癌時已發(fā)生了轉移，且有40%的NSCLC已發(fā)生遠處轉移[12]，隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，如何快速、早期、精確、無創(chuàng)地診斷肺癌，對影像醫(yī)學提出了更高的要求。目前在肺癌PET/CT無創(chuàng)顯像領域已應用到臨床的顯像劑是18F-FDG，它是一種葡萄糖的類似物，惡性腫瘤因局部缺氧和腫瘤生物學行為使其代謝速率異常增高，耗糖量增加，18F-FDG即可通過細胞膜上的葡萄糖載體進入細胞內而顯像。但由于18F-FDG并非腫瘤的特異性顯像劑，肺炎、支氣管擴張、活動性肺結核和肉芽腫等的炎癥反應也可以攝取18F-FDG，造成18F-FDG PET/CT高達10%左右的假陽性率，導致一部分患者失去早期手術機會[13]。此外，由于部分分化較好，生長緩慢的腫瘤組織因對葡萄糖的依賴性低、糖代謝異常不明顯，還會導致PET/CT顯像一定程度的假陰性率[14]。基于上述原因，尚需發(fā)現(xiàn)更新更特異的肺癌診斷顯像劑來提高肺癌診斷的準確率。

圖 6 99mTc-T7在荷人NCI-H157裸鼠異位模型體內生物分布（%ID/g）Fig 6 The biodistribution of 99mTc-T7 in NCI-H157-bearing nude mice model (%ID/g)

圖 7 99mTc-T7在荷人NCI-H157裸鼠異位模型分布特異性分析（T/NT）Fig 7 Specificity analyzing of the 99mTc-T7 biodistribution in NCIH157-bearing nude mice model(T/NT)

已有研究[15]表明，αvβ3整合素在腫瘤新生血管增生顯像方面具有極大潛力，此外，αvβ3整合素靶向藥物的研究也已處于臨床I期和II期，據(jù)此，Beer等[16]將其研制的αvβ3靶向藥物18F-galacto-RGD與基于葡糖糖代謝的18F-FDG進行了對比，雖未表明兩者間存在一定關系，但在一良性支氣管腫瘤患者的原位及轉移部位發(fā)現(xiàn)18F-galacto-RGD的攝取值明顯高于18F-FDG，結果表明αvβ3受體顯像劑對于18F-FDG攝取值較低的良好腫瘤的顯像診斷具有極大優(yōu)勢。本研究所采用的T7肽，亦是源于靶向αvβ3受體的腫瘤抑素Tumstatin上的一個有效作用片段，T7肽分子量小，免疫原性高，靶向性強，基于99mTc-T7可以與腫瘤新生血管和部分腫瘤細胞表面高表達的αvβ3整合素結合來診斷肺癌，99mTc-T7對炎癥的親和力低，且能發(fā)現(xiàn)良性腫瘤病灶，可以與18F-FDG聯(lián)合顯像提高肺癌診斷準確率，避免患者錯失早期手術機會，99mTc-T7有望成為肺癌SPECT/CT顯像的早期特異性顯像劑，降低肺癌早期診斷中存在的假陽性率和假陰性率，提高患者的存活率和存活時間。

目前多肽和蛋白質的放射性標記方法有很多，125I、131I、3H、18F、99mTc、72As、188Re、75Br、86Yt等，由于99mTc具有適宜的半衰期（T1/2=6.01 h）和γ光子能量（140 keV），它是SPECT顯像的最佳核素；此外，99mTc以99mTcO4-的化學形態(tài)很容易從99Mo-99mTc發(fā)生器用生理鹽水淋洗得到，價格低廉；它還可以和各種配體形成種類繁多、具有多種化學價態(tài)和不同生物分布性質的放射性藥物，目前已合成的99mTc-藥物幾乎能對人體所有臟器進行顯像，以活體內各類生物大分子為靶目標，進行分子水平的顯像，觀察它在體內的吸收、分布、代謝過程，加速新藥的開發(fā)[17]。羰基锝標記方法操作簡便，標記率高，產(chǎn)物穩(wěn)定性好。

本研究所得的99mTc-T7放化純高于90%，在37oC生理鹽水和37oC人血清中放置8 h后，放化純均仍高于90%，穩(wěn)定性高。通過體外細胞親和力實驗發(fā)現(xiàn)，在暫無腫瘤新生血管增生的情況下，99mTc-T7與NCI-H157細胞的KD值已達到131.6 nM的水平。通過99mTc-T7在裸鼠肺癌模型體內生物分布研究發(fā)現(xiàn)99mTc-T7對αvβ3受體具有高度的選擇性和親和力，在荷瘤鼠體內的腫瘤/肌肉放射性比值（T/NT）可達到5以上，在4 h-8 h之間取值較為理想，研究還發(fā)現(xiàn)99mTc-T7在肺內存在一過性聚集。此外，99mTc-T7主要通過內臟器官代謝，血液清除較快，對其進行適當修飾后有望用作肺癌SPECT/CT顯像劑，用于肺癌的早期鑒別診斷、腫瘤分期、指導肺癌治療方案的修訂與修改、勾畫放射性治療靶區(qū)、判斷預后療效、檢測肺癌的術后殘余和復發(fā)，還利于尋找遠處肺癌轉移灶，穿刺活檢定位等。本文對99mTc-T7在肺癌顯像領域的應用做了初步探討，其是否能用做肺癌SPECT/CT顯像劑還有待于其在SPECT/CT顯像、藥代動力學等方面展開更深入的研究。