pH變化對鯰魚肌漿蛋白理化和功能特性的影響

李鵬，李沛然，郭耀華，岳蘭昕，張乃琳，劉彩虹，馬儷珍

（1.天津農學院水產科學系，天津 300384；2.天津農學院動物科學系，天津 300384；3.天津農學院食品科學系，天津 300384）

pH變化對鯰魚肌漿蛋白理化和功能特性的影響

李鵬1，李沛然2，郭耀華1，岳蘭昕2，張乃琳2，劉彩虹2，馬儷珍3，*

（1.天津農學院水產科學系，天津 300384；2.天津農學院動物科學系，天津 300384；3.天津農學院食品科學系，天津 300384）

摘 要：提取鯰魚肉漂洗液中的肌漿蛋白，用酸或堿以5種方式（①pH=3.0→7. 0；②pH=5.0→7. 0；③pH=7.1→7. 0；④pH=9.0→7. 0；⑤pH=11.0→7.0）調節其pH后，研究經過這種pH變化后的肌漿蛋白的蛋白溶解度、表面疏水性、總巰基含量、SDS-PAGE、流變性和熱變性等指標的變化，以期為漂洗液中肌漿蛋白的綜合利用奠定理論基礎。研究結果表明：隨著pH向酸性或者堿性的方向逐漸變化，肌漿蛋白溶解度、表面疏水性和總巰基含量不斷下降，蛋白氧化加劇，流變學特性（黏度值）和熱變性溫度不斷增加。

關鍵詞：鯰魚；肌漿蛋白；pH；理化特性；功能特性

魚體內肌漿蛋白含量占到了全魚肌肉蛋白的20%～50%，并且肌漿蛋白中包含了一些參與魚體肌肉能量新陳代謝相關的酶[1]；其中主要有肌酸激酶、醛縮酶和甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶[2]。然而人們長時間以來認為肌漿蛋白會影響肌原纖維蛋白的凝膠性，因此在魚肉產品生產中，為生產成為“魚糜（肌原纖維蛋白的集中產物）”，大量的肌漿蛋白在漂洗過程中會被去除，以便后期更好的加工和貯藏。據研究發現，在魚糜生產加工中，每生產100 kg的魚糜，將會產生50 kg的肌漿蛋白[3]。因此，找到一條切實可行的肌漿蛋白利用方法是至關重要的，這不僅能降低廢水處理的負荷，而且能夠有效地利用魚類資源。

近年來，有關肌漿蛋白可以提高魚糜的凝膠效果研究被廣泛涉及。沙丁魚肌漿蛋白通過硫酸銨分級處理可以增加沙丁魚魚糜的存儲模量[3]。添加了羅非魚肌漿蛋白的蜥魚魚糜制得的凝膠，其凝膠強度有所提高[4]。主要原因是肌漿蛋白中含有一定量的具有一定活力的谷氨酰胺轉氨酶（TGase）[5]。肌漿蛋白除能增強魚糜的凝膠性以外，其他的有關肌漿蛋白的功能特性研究報道很少。Krasaechol（2008）等研究發現通過化學修飾，如乙?；饔煤鸵鹊鞍酌感揎椩黾恿私鹁€魚肌漿蛋白的乳化性和起泡性[5]。盡管化學修飾可以改善一些食品蛋白的功能特性，但這些方法并沒有廣泛應用于食品行業。

當蛋白質遭受極酸性或極堿性處理時，其隨后會發生構象變化，影響其功能性質[6]。當魚肉蛋白處于一定的pH變化范圍內時，其凝膠特性會相應提高[7]。在這個過程中，肌肉蛋白質首先對其進行極酸性或極堿性pH處理，此時蛋白具可溶性，隨后將其恢復到等電點（pH約為5.5）從而產生沉淀[7]。pH變化導致了肌漿球蛋白重鏈的部分伸展和重新折疊，導致肌球蛋白融化形成球體狀態；當肌漿球蛋白在酸和堿的環境下溶解，之后將混合物中和至pH7.5時，使其表面疏水基團暴露和伸展，從而導致其表面界面活力增加，乳化能力提高[6]。因此，pH變化可以一定程度地改善肌漿蛋白功能特性。本試驗旨在研究不同梯度pH對肌漿蛋白各項理化及功能特性的影響，從而為肌漿蛋白在食品中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鯰魚（Clarias gariepinus）：體重（1±0.2）kg，體長（37±3）cm，2013年10月購于天津市西青區紅旗農貿市場。

1 mol/L 的 HCl，1 mol/L 的 NaOH，溴酚藍，考馬斯亮藍R-250，聚丙烯酰胺，過硫酸銨，甘油，尿素，Tris-HCl，酒石酸鉀鈉等均為分析純。

1.2 儀器

酸度計（PB-10）：賽多利斯科學儀器有限公司；高速剪切分散乳化機（FA25）：德國弗魯克公司；紫外分光光度計（UV-1800）：日本島津公司；流變儀（R/S+）：美國Brookfield公司；差示掃描量熱儀（DSC200F3）：德國耐馳；冷凍離心機（ST40R）：德國Theromo Scientific；電泳儀（MINI 4）：美國伯樂（Bio-Rad）公司。

1.3 方法

1.3.1 鯰魚肌漿蛋白的制備

鯰魚經宰殺后采肉、絞碎，在碎肉中添加3倍體積的蒸餾水（4℃）勻漿（高速剪切乳化分散機，B檔），然后5 500 r/min離心20 min（4℃），上清液用兩層紗布過濾，得到鯰魚肌漿蛋白（CL-SP）。

1.3.2 pH處理

制得的CL-SP初始pH為7.1，分別用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH調整CL-SP的pH為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，攪拌均勻后隨即將各溶液的pH再調整回7.0。

1.3.3 蛋白溶解度的測定

將CL-SP在4℃，5 500 r/min離心20 min，利用雙縮脲法測定其上清液中的蛋白含量。蛋白溶解度測定結果表示為每毫升上清液中肌漿蛋白的毫克數，即單位為mg/mL。

1.3.4 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定依據Chelh（2006）的方法[8]。將肌漿蛋白溶于pH 7.0，20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，肌漿蛋白濃度為5 mg/mL。取1 mL加入200 μL的溴酚藍（BPB，1 mg/mL）混勻，室溫下攬拌10 min，然后7500r/min離心15min，上清液（稀釋10倍后）在595nm下測定吸收值A。空白樣用1 mL pH 7.0，20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液加200 μL BPB，磷酸鹽緩沖液作空白樣。表面疏水性計算公式為：

1.3.5 總巰基含量的測定

巰基含量的測定參考Ellman的方法[9]。

1.3.6 流變學測定

采用R/S+型流變儀，選擇50 mm，1°的錐轉子（CC40）流變測量系統，測定流變特性。測定：剪切率從0 s-1增加到100 s-1，再從100 s-1減小到0 s-1，完成一次循環，測定CL-SP黏度隨剪切率的變化。

1.3.7 SDS-PAGE

SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）參考Laemmli的方法[10]。

1.3.8 熱變性溫度的測定

測定采用差示掃描量熱法，稱取樣品5 mg～15 mg，密封在鋁盒中并放入樣品池，以空盒做參比，保護氣為氮氣，升溫速率8℃/min，溫度范圍10℃～120℃。

1.3.9 數據處理

實驗重復兩次，每次取樣是3個平行樣品進行數據測定。數據分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進行，使用Turkey test程序進行差異顯著性（P＜0.05）分析。繪圖軟件采用SigmaPlot 10.0。

2 結果與討論

2.1 酸堿處理對CL-SP蛋白溶解度的影響

蛋白溶解度是評價蛋白功能特性的重要指標，經不同酸堿處理后的CL-SP蛋白溶解度變化如圖1所示。

圖1 酸堿處理后鯰魚肌漿蛋白蛋白溶解度的變化Fig.1 Protein solubility of CL-SP subjected to various pH treatments

CL-SP的未處理組蛋白溶解度為10.36 mg/mL，經過不同的酸堿處理后，其蛋白溶解度均表現為不同程度的降低，其中pH為3.0→7.0和pH為11.0→7.0的處理組蛋白溶解度降低最為明顯，分別降至3.14 mg/mL和7.95 mg/mL，與未處理組差異顯著（P<0.05）。其余三組中，pH為7.1→7.0組的蛋白溶解性變化不明顯（P<0.05），pH為5.0→7.0和pH為9.0→7.0的蛋白溶解度變化與對照組差異亦達顯著水平（P<0.05）。造成蛋白溶解度下降的主要原因是因為酸堿處理導致蛋白在等電點處沉淀，且極端的pH會導致肌漿蛋白分子展開。這一研究結果與Jirawat（2010）等的研究報道相一致，Jirawat（2010）研究發現，酸堿處理金線魚肌漿蛋白后，pH為3和pH為12時其蛋白分子片段展開，導致溶解度下降。當重新調回pH為7時，蛋白分子進行了重新折疊和聚合，進一步導致蛋白溶解度的降低[11]。

2.2 酸堿處理對CL-SP表面疏水性的影響

酸堿處理CL-SP后其表面疏水性的變化如圖2所示。

圖2 酸堿處理后鯰魚肌漿蛋白表面疏水性的變化Fig.2 Surface hydrophobicity of CL-SP subjected to various pH treatments

對照組pH和pH為7.1→7的處理組其溴酚藍含量（81.0 μg 和 81.49 μg）最高，其對應的表面疏水性最強，經過酸堿處理后pH=3.0→7.0和pH=11.0→7.0處理組下降最多，含量分別為47.50 μg和45.43 μg。當肌漿蛋白遭受極端pH（pH=3和pH=11）處理時，蛋白結構發生伸展，并且在中和反應過程中不斷促進疏水相互作用，結果導致表面疏水性含量明顯下降。Jirawat.Y.和Bung-orn.H.（2010）在研究pH對金線魚肌漿蛋白結構影響中指出，經傅里葉紅外光譜掃描pH=12時其蛋白伸展和聚合程度要高于pH=9[11]。Gratacos-Cubarsi和Lametsch（2008）報道指出，隨著pH環境的加劇，部分肌漿蛋白（例如肌酐酸激酶M、醛縮酶A抗體和乳酸脫氫酶）含量上升。在調整pH至蛋白等電點時，導致了蛋白構象上的改變，也是表面疏水性下降的原因[14]。

2.3 酸堿處理對CL-SP巰基含量變化的影響

不同酸堿處理CL-SP后的巰基含量變化如圖3所示。

圖3 酸堿處理后鯰魚肌漿蛋白總巰基含量的變化Fig.3 Total sulfydryl content of CL-SP subjected to various pH treatments

相比較而言巰基含量在pH為7.1→7.0組最高（49.29 nmol/mg蛋白），與對照組沒有差異（P<0.05），隨著pH向酸性或者堿性的逐漸變化，SH含量逐漸下降，在pH為3.0→7.0和pH為11.0→7.0組時巰基含量分別降為24.72 nmol/mg蛋白和35.93 nmol/mg蛋白（P<0.05）。結果表明在進行酸堿處理時肌漿蛋白巰基發生了氧化，且處理越劇烈，氧化程度越強。此結果與Thawornchinsombut和 Park（2004）在研究太平洋鱈魚魚肉時發現pH為4和pH為10時蛋白總巰基含量低于pH為7的結果一致[12]。在酸堿處理過程中，肌漿蛋白構象上的改變結果使SH的暴露，導致二硫鍵的形成，從而降低巰基含量。同時等電點沉淀和后期的中和反應都會影響總巰基含量的變化[13]。

2.4 酸堿處理對CL-SP流變學特性的影響

圖4反映了5組酸堿處理CL-SP后在4℃下的流變學特性變化。

圖4 酸堿處理后鯰魚肌漿蛋白流變學特性的變化Fig.4 Rheological property of CL-SP subjected to various pH treatments

由圖4可以看出，所有處理其流變學特性均發生了顯著性變化，呈現“假塑形”；最初黏度值最高，隨著剪切率的升高，其黏度值不斷下降，黏度降幅之間差異逐漸減小，最終趨于0 Pa*s。同時隨著pH向酸性或者堿性的方向逐漸變化，其最高黏度值不斷升高，相比較 pH=7.1→7.0（8.174 9 Pa*s）組，pH 為 3.0→7.0 和pH為11.0→7.0處理組，其黏度值達到最高值（12.676 9 Pa*s和12.242 2 Pa*s）。在酸堿處理和中和反應的過程中，蛋白發生伸展和聚合，形成一定量的沉淀蛋白分散于蛋白樣品中，從而在流變過程中產生相應的阻力，所以黏度逐漸升高。

2.5SDS-PAGE

蛋白質氧化的主要表現之一是蛋白聚集，在某些情況下，形成蛋白片段[14]。圖5為不同pH處理組的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

由圖5可以看出肌漿蛋白在分子量116 ku～200 ku時，pH為3.0→7.0和pH為11.0→7.0處理組條帶深度弱于其他三個處理組。這種情況相應的在其他分子量（66 ku～97 ku、46 ku～66 ku、21 ku～46 ku） 時也有發生，且pH為3.0→7.0處理組表現的尤為明顯。然而其他三組處理（pH為5.0→7.0、pH為7.1→7.0和pH為9.0→7.0）之間差異不顯著。這一結果的主要原因是極端pH誘發大量的蛋白分子結構伸展，蛋白分子之間發生聚合，從而導致蛋白溶解度降低。這與Jirawat和Bung-orn（2010）的研究結果一致[11]；同時從圖 3中可以看出在酸堿處理過程中，隨著pH向酸性或者堿性的方向逐漸變化，肌漿蛋白總巰基含量下降，氧化程度提高，在處理過程中蛋白發生了交聯聚合以及蛋白降解。

圖5 酸堿處理后鯰魚肌漿蛋白SDS-PAGE情況Fig.5 SDS-PAGE of CL-SP subjected to various pH treatments

2.6 pH變化和凍干處理對CL-SP熱變性溫度的影響

蛋白質的熱變性過程可以看作是溫度的動態函數。蛋白質在熱變性過程中，吸收熱量時由一個有序狀態變為無序狀態，分子內相互作用被破壞，多肽鏈展開。當達到蛋白質的變性溫度時，在熱分析圖譜上會出現一個吸熱峰[15]。

圖6 酸堿處理后鯰魚肌漿蛋白熱變性的變化Fig.6 The change of thermal denaturation of CL-SP subjected to various pH treatments.

由圖6可以看出所有處理組都有一個主要的吸收峰，代表了CL-SP的熱變性溫度點。隨著pH向酸性或者堿性的方向逐漸變化，熱變性溫度值由59.16℃（pH為7.1→7.0處理組）逐漸升高至88.97℃（pH為3.0→7.0處理組）和 86.08℃（pH為11.0→7.0處理組）。在肌漿蛋白為對照組和pH為7.1→7.0處理組時，表面基本不帶電荷，這樣致使蛋白在較低的溫度下就會熱變性。當pH在調整到極端酸堿環境的過程中（如3.0→7.0和11.0→7.0），蛋白表面攜帶了越來越多的電荷，因此需要更高的溫度去克服靜電作用力和誘發蛋白和蛋白之間的相互作用。研究結果表明，肌漿蛋白的聚合變性很大程度上取決于其pH的變化[16]。

3 結論

鯰魚肌漿蛋白（CL-SP）在通過不同酸堿處理后，其蛋白氧化水平、流變學特性和熱變性都發生了不同程度的變化。相對于初始pH環境下的CL-SP，隨著pH向酸性或者堿性的方向逐漸變化，肌漿蛋白的蛋白溶解度、表面疏水性和巰基含量顯著下降（P<0.05），pH=3.0→7.0和pH=11.0→7.0處理組分別降為最低值，且從電泳圖譜可以看出氧化水平不斷加?。籆L-SP處理組流變性和熱變性方面，隨著pH向酸性或者堿性的方向逐漸變化，黏度值和熱變性溫度不斷上升。

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[1]Nakagawa T,Watabe S,Hashimoto K.Identification of three major components in fish sarcoplasmic proteins[J].Nippon Suisan Gakkai Shi,1988a(54):999-1004

[2]Nakagawa T,Watabe S,Hashimoto K.Electrophoretic analysis of sarcoplasmic proteins from fish muscle on polyacrylamide gels[J].Nippon Suisan Gakkai Shi,1988b(54):993-998

[3]Karthikeyan M,Mathew S,Shamasunur B A,Prakash V.Fractionation and properties of sarcoplasmic proteins from oil sardine(Sardinell alongiceps):influnce on the thermal gelation behavior of washed meat[J].Food science,2004(69):FEP79-84

[4]Yongsawatdigul J,Piyadhammaviboon P.Gel-enhancing effect and protein cross-linking ability of tilapia sarcoplasmic proteins[J].Science of Food and Agriculture,2007(87):2810-2816

[5]Krasaechol N,Ranguandeekul R,Duangmal K,Owusu-Apenten RK.Structure and functional properties of modified threadfin bream sarcoplasmic proteins[J].Food Chemistry,2008(107):1-10

[6]Kristinsson HG,Hultin HO.Effect of low and high pH treatment on functional properties of cod muscle proteins[J].Agricultural and Food Chemistry,2003a(51):5103-5110

[7]Hultin HO,Kelleher SD.Process for isolating a protein composition from amuscle source and protein composition[P].U S Patent,1999:6,005,073

[8]Chelh I,Gatellier P,Sante-Lhoutellier V.Technical note:A simplified procedure for myofibril hydrophobicity determination[J].Meat Science,2006,74(4):681-683

[9]Ellman G L.Tissue sulfhydryl groups[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,1959(82):70-77

[10]Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970(227):680-685

[11]Jirawat Y,Bung-orn H.Structural Changes and Functional Propertiesof Threadfin Bream Sarcoplasmic Proteins Subjected to pHShifting Treatments and Lyophilization[J].Food Science,2010(75):C251-C257

[12]Thawornchinsombut,S Park,J W.Role of pH in solubility and conformational changes of Pacific whiting muscle proteins[J].Food Biochemistry,2004(28):135-154

[13]Panchaporn.T,Jae W.Park,etc.Structural Changes and Dynamic Rheological Properties of Sarcoplasmic Proteins Subjected to pHShift Method[J].Agricultural and Food Chemistry,2010(58):4241-4249

[14]Gratacos-Cubarsi M,Lametsch R.Determination of changes in protein conformation caused by pH and temperature[J].Meat science,2008(80):545-549

[15]李永明,徐子偉.差示掃描量熱法(DSC)評定豆粕產品質量初探[J].中國糧油學報,2003,18(5):82-84

[16]Panchaporn Tadpitchayangkoon,Jae W.Park,Jirawat Yongsawatdigul.Conformational changes and dynamic rheological properties of fish sarcoplasmic proteins treated at various pHs[J].Food chemistry,2010(121):1046-1052

Physicochemical and Functional Characteristics Changes of Catfish Sarcoplasmic Proteins Subjected to pH-Shift Method

LI Peng1，LI Pei-ran2，GUO Yao-hua1，YUE Lan-xin2，ZHANG Nai-lin2，LIU Cai-hong2，MA Li-zhen3，*
（1.The Department of Aquatic Science of Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；2.The Department of Animal Science of Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；3.The Department of Food Science of Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China）

Abstract：This paper used the sarcoplasmic protein of washing water from catfish （Clarias gariepinus）， and subjected to pH-shift method （pH=3.0→7.0，pH=5.0→7.0，pH=7.1→7.0，pH=9.0→7.0，pH=11.0→7.0）as the research object.Each treatment group was analyzed by protein solubility，surface hydrophobicity，total sulfhydryl content， SDS-PAGE， rheological property and the change of thermal denaturation.Results showed， as the environment of pH to the direction of the acidic or alkaline，sarcoplasm protein solubility，surface hydrophobicity and total sulfydryl content had decreased， protein oxiution increased， meanwhile， rheological properties（viscosity） and thermal denaturation temperature improved.

Key words：catfish （Clarias gariepinus）；sarcoplasmic protein；pH；physicochemical properties；functional characteristics

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.002

天津市科委科技支撐項目“淡水魚魚糜安全及品質控制和副產物高值化利用關鍵技術研究與工程示范（項目編號：13ZCZDNC01600）”

李鵬（1988—），男（漢），研究生，研究方向：水產品質量與安全。

馬儷珍（1963—），女（漢），教授，研究方向：畜產和水產加工技術。

2013-12-30