硒化枸杞多糖的制備及其抗氧化性研究

郝苗，金黎明，劉李娜，許永斌，馬堃，范圣第

（1．大連市產品質量監督檢驗所，遼寧大連 116021；2．大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116600；3．海軍醫學研究所，上海 200443）

硒化枸杞多糖的制備及其抗氧化性研究

郝苗1，金黎明2，*，劉李娜3，許永斌2，馬堃2，范圣第2

（1．大連市產品質量監督檢驗所，遼寧大連 116021；2．大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116600；3．海軍醫學研究所，上海 200443）

摘 要：以亞硒酸鈉和枸杞多糖為原料合成硒化枸杞多糖，電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）測定其中硒含量為64.42 mg/g。利用紫外-可見光譜、紅外光譜兩種表征手段，證實了硒化枸杞多糖的合成。采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法測定硒化枸杞多糖的抗氧化能力，結果表明，在實驗設置的濃度范圍內，硒化枸杞多糖的抗氧化能力隨著濃度的增加而增加，且高于枸杞多糖。2.0 mg/mL的枸杞多糖和硒化枸杞多糖對超氧陰離子自由基的清除率分別為51.48%和59.34%，對羥自由基的清除率分別為50.23%和56.16%。本實驗為進一步研究硒化枸杞多糖作為抗氧化能力較強的食品和藥品的可能性奠定了基礎。

關鍵詞：硒化枸杞多糖；合成；表征；電感耦合等離子體質譜；抗氧化性

枸杞是我國傳統名貴中藥材，素有“紅寶”美稱， 富含植物多糖、蛋白質、維生素等營養成分。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP） 是枸杞主要的有效成分之一，具有增強機體免疫調節功能、減少體內脂肪含量、抗腫瘤、抗衰老等多種生理功能[1]。

硒（selenium）是人體所必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗癌、延緩衰老、增強人體免疫力等功效。但大多數無機硒化合物毒性較大，應用受到了限制。硒多糖作為一種有機硒化合物，使用安全且兼有硒與多糖二者的活性，更加易于機體吸收和利用[2]。目前已有許多研究證明，硒多糖具有抗氧化、抗金屬中毒、抗癌細胞和病毒等多種作用[3-4]。

某些動植物和微生物體內含有天然硒多糖，但含量很少，使硒多糖的研究受到了一定限制。近年來，研究者嘗試使用人工方法獲得硒多糖，如在合適的培養條件下把無機硒添加到藻類、真菌等培養基中，通過生物體自身富集和轉化來獲得硒多糖[5-6]。或者利用化學合成方法獲得硒多糖，如硒化角叉菜膠[7]、硒化紅薯葉多糖[8]、硒化白沙蒿多糖[9]、硒化羧甲基殼聚糖[10]等。

本實驗以亞硒酸鈉和枸杞多糖為原料合成硒化枸杞多糖（selenium-Lycium barbarum polysaccharide，SeLBP），利用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法測定其中硒含量，利用紫外-可見光譜、紅外光譜兩種方法對其進行表征，并采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法測定SeLBP的抗氧化能力。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

枸杞提取物，西安天一生物技術有限公司。抗壞血酸（VC），亞硒酸鈉，無水乙醇，冰乙酸，鹽酸，硝酸，甲苯，濃硝酸，雙氧水，鄰苯三酚，鄰二氮菲等，均為國產分析純試劑。

1.1.2 儀器

Lambda25型紫外-可見分光光度計：美國PE公司；370DTGS型紅外光譜儀：美國Thermo公司；7700X Series型電感耦合等離子體質譜儀：美國Agilent公司；DF-101S型恒溫磁力攪拌器：鞏義市英峪于華儀器廠；DHG-9070A型真空干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；SevenEasy型pH計：上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枸杞多糖的純化

稱取適量枸杞多糖提取物，用2倍體積的乙酸乙酯脫脂，充分搖勻靜置后，取濾渣。加入適量蒸餾水將干燥后的濾渣溶解，加入25%體積的正丁醇-氯仿混合液（正丁醇∶氯仿=1∶4），劇烈振蕩20min。4000r/min離心10 min，傾出上清液，除去中間層變性蛋白和下層氯仿。重復以上操作，直至中間層無變性蛋白。

向上清液中加入3倍體積的無水乙醇，冰箱冷藏過夜，得到多糖沉淀，冷凍干燥得到純化的LBP。

1.2.2 枸杞多糖中多糖含量測定

用苯酚-硫酸法測定LBP中多糖含量[11]。

1.2.3 硒化枸杞多糖的制備

參考梁淑軒等[12]的方法，稱取1 g純化后的LBP溶解于25 mL超純水中，磁力攪拌溶解后加入1 mL冰醋酸。取1 g亞硒酸鈉溶于少量超純水，緩慢加入LBP溶液中，磁力攪拌器上50℃下反應48 h。加入3倍體積無水乙醇，使其沉淀完全。離心得到沉淀后用無水乙醇洗滌3次，加入少量的超純水溶解，用超純水透析24 h，未透液經冷凍干燥得到SeLBP。

1.2.4 紫外光譜法測定

將LBP和SeLBP用去離子水配成0.5 mg/mL的溶液，用去離子水為參比，進行紫外光譜測定，波長掃描范圍為190 nm～400 nm。

1.2.5 紅外光譜法測定

將少量的LBP和SeLBP用KBr壓片，進行紅外吸收光譜測定，測定范圍為400 cm-1～4 000 cm-1。

1.2.6 電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法測定硒含量

準確稱取適量SeLBP于干燥的聚四氟乙烯消解罐內，加入4 mL硝酸，1 mL H2O2搖勻，密封，置入微波消解系統中進行消解，消解完全后，用少量超純水洗罐3次～4次，定容。上ICP-MS測定，樣品定量分析采用外標法，內標元素選用89Y。做3個平行實驗，得出平均值。根據標準曲線計算出其中硒含量。

1.2.7 抗氧化能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定LBP和SeLBP清除超氧陰離子自由基的能力，并以VC為對照實驗[13]。

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定LBP和SeLBP清除羥自由基的能力，并以VC為對照實驗[13]。

2 結果與討論

2.1 枸杞多糖中多糖含量測定

根據圖1葡萄糖標準曲線，計算得出純化后的LBP中多糖百分含量為66.44%。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 硒化枸杞多糖的制備及硒含量測定

得到的SeLBP為深黃色固體，產率為56.81%。經ICP-MS測定其中硒含量為64.42 mg/g。

目前化學法合成硒化多糖常用SeOCl2、亞硒酸、亞硒酸鈉等作為硒化試劑。Junlong Wang等[9]用H2SeO3/HNO3和BaCl2做催化劑，合成了硒化白沙蒿多糖，發現強酸會使多糖降解。本實驗參考了梁淑軒等[12]的方法，以醋酸做為催化劑，反應條件為50℃，反應48 h。制備得到的SeLBP中硒含量為64.42mg/g，顯著高于一些文獻報道，如合成的硒化紅薯葉多糖中硒含量為 358 μg/g[8]、硒化白沙蒿多糖中硒含量為 1 703 μg/g[9]、硒化羧甲基殼聚糖中硒含量為20.50 mg/g[10]。

2.3 紫外圖譜

LBP紫外光譜見圖2。

圖2 枸杞多糖和硒化枸杞多糖的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV spectrum of LBP and SeLBP

從圖2中可以看出，LBP經硒化后，最大吸收峰從281 nm轉移到275 nm，峰值的變化表明了LBP中成功引入了亞硒酸根。

2.4 紅外圖譜

LBP和SeLBP的紅外光譜見圖3。

圖3 枸杞多糖和硒化枸杞多糖的紅外光譜圖Fig.3 IR spectrum of LBP and SeLBP

由圖3可知，LBP經硒化后的紅外圖譜變化不大，說明多糖的結構基本沒有改變。硒化后，在795 cm-1處出現有亞硒酸酯的特征吸收峰。LBP的C6-OH的伸縮振動峰由1 026 cm-1紅移至1 031 cm-1，說明C6上的-OH可能參與了硒化反應。

2.5 對超氧陰離子自由基的清除作用

LBP和SeLBP對超氧陰離子自由基的清除作用結果見圖4。

圖4 枸杞多糖和硒化枸杞多糖對超氧陰離子自由基的清除率曲線Fig.4 Curves of scavenging effect on superoxide radicals of LBP and SeLBP

從圖4可以看出，LBP和SeLBP對超氧陰離子自由基均有不同程度的清除作用，隨著濃度的增加而增強，且SeLBP的清除作用強于LBP。濃度為2.0 mg/mL的LBP和SeLBP對超氧陰離子的清除率分別為51.48%和59.34%，高于2.0 mg/mL的VC。

2.6 對羥自由基的清除作用

LBP和SeLBP對羥自由基的清除作用結果見圖5。

圖5 枸杞多糖和硒化枸杞多糖對羥自由基的清除率曲線Fig.5 Curves of scavenging effect on hydroxyl radicals of LBP and SeLBP

從圖5可以看出，LBP和SeLBP對·OH都具有一定的清除作用，呈濃度依賴關系，且SeLBP的清除能力更強。以濃度為2.0 mg/mL的LBP和SeLBP為例，對·OH的清除率分別為50.23%和56.16%，接近于2.0 mg/mL 的 VC。

3 結論

本實驗以亞硒酸鈉和LBP為原料合成SeLBP，ICP-MS測定其中硒含量為64.42 mg/g。利用紫外-可見光譜、紅外光譜兩種表征手段，證實了SeLBP的合成，硒化反應主要通過C6上的-OH完成。SeLBP的抗氧化能力呈濃度依賴關系，且由于引入了硒這種具有抗氧化能力的元素，在同樣濃度條件下的抗氧化能力要高于LBP。2.0 mg/mL的LBP和SeLBP對超氧陰離子自由基的清除率分別為51.48%和59.34%，對羥自由基的清除率分別為50.23%和56.16%。本實驗合成的SeLBP既具有抗氧化能力，又有補硒作用，是一種較為理想的有機補硒產品。

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[1]嚴成,嚴夏.枸杞多糖提取工藝比較及體外抗氧化性研究[J].食品科學,2008,29(7):183-186

[2]黃峙,鄭文杰,郭寶江,等.含硒生物大分子化合物研究進展[J].海南大學學報:自然科學版,2001,19(2):169-175

[3]崔喬,尚德靜,鄒霞.硒多糖的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2003,24(3):155-157

[4]Hsien-Tung Chen,Ying-Lan Tsai,Yueh-Sheng Chen,et al.Dangshen(Codonopsis pilosula)activates IGF-I and FGF-2 pathways to induce proliferation and migration effects in RSC96 Schwann cells[J].The American Journal of Chinese Medicine,2010,38(2):359-372

[5]C L Xu,Y Z Wang,M L Jin,et al.Preparation,characterization and immunomodulatory activity of selenium-enriched exopolysaccharide produced by bacterium Enterobacter cloacae Z0206[J].Bioresource Technology,2009,100:2095-2097

[6]張新宇,王雷,李光友,等.綠色巴夫藻硒多糖的提取分離與純化[J].海洋與湖沼,2000,31(0):643-646

[7]唐家駿,苗海風.硒化角叉菜膠的制備及其理化性質和生化活性研究[J].生物化學與生物物理學報,1988,20(3):259-261

[8]劉捷,張體祥,于立芹,等.硒化紅薯葉多糖的制備及抗氧化活性研究[J].食品研究與開發,2009,20(7):8-11

[9]Junlong Wang,Baotang Zhao,Xiaofang Wang,et al.Synthesis of selenium-containing polysaccharides and evaluation of antioxidant activityinvitro[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2012,51:987-991

[10]金黎明,覃仙玲,曹鵬,等.硒化羧甲基殼聚糖的合成及表征[J].化學世界,2012,53(1):31-32,36

[11]趙曉蕾,王小瑜,李恃圻,等.莊河產薏苡仁中多糖含量的測定[J].安徽農業科學,2011,39(27):17026-17029

[12]梁淑軒,馬二紅,趙燕燕,等.醋酸催化下枸杞多糖的硒化修飾及抗腫瘤活性[J].食品研究與開發,2011,32(3):160-164

[13]金黎明,郝苗,趙小菁,等.硒化殼寡糖的合成及抗氧化作用研究[J].大連民族學院學報,2012,14(5):445-448

Synthesis and Antioxidant Activity of Selenium-Lycium Barbarum Polysaccharide

HAO Miao1，JIN Li-ming2，*，LIU Li-na3，XU Yong-bin2，MA Kun2，FAN Sheng-di2
（1.Dalian Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Dalian 116021，Liaoning，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，Liaoning，China；3.Naval Medical Research Institute，Shanghai 200443，China）

Abstract：Sodium selenite and Lycium barbarum polysaccharide （LBP） were used to synthesize selenium-Lycium barbarum polysaccharide （SeLBP）in this experiment by chemical method.The content of selenium was determined by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）and the result was 64.42 mg/g.SeLBP was characterized by visible ultraviolet （UV-VIS） and infrared （IR） techniques.The results proved the successful synthesis of SeLBP.The antioxidant activities in vitro of SeLBP was investigated by phenanthroline-Fe2+andpyrogallolautoxidationmethod.The resultsshowedthatinthe setting concentrationrange，the antioxidant activities increased with the elevation of concentration.The antioxidant activities of SeLBP were better than that of LBP.The clearance rates on superoxide anion radical of 2.0 mg/mL LBP and SeLBP were 51.48%and 59.34%，respectively.The scavenging rates on hydroxyl radical of 2.0 mg/mL LBP and SeLBP were 50.23%and 56.16%，respectively.This research was an important step as means of laying the foundation for further research on SeLBP as a low toxicity and effective organic selenium product.

Key words：selenium-Lycium barbarum polysaccharide （SeLBP）； synthesis； characterization； inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）；antioxidant activity

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.004

國家自然科學基金（21172028）；遼寧省教育廳項目（L2013510）；中央高校基本科研業務費（DC110318）；海軍醫學研究所基金（12HY03）

郝苗（1976—），女（漢），高級工程師，碩士，研究方向：食品分析。

金黎明（1979—），女（朝鮮），副教授，博士，研究方向：生物活性物質。

2013-08-13