超聲波輔助酶法水解尋氏肌蛤蛋白

孔美蘭，劉謀泉，孔德虎，袁秀霞，林繼娜，沈少游，吳悅婷

（1.韓山師范學院生物系，廣東潮州 521041；2.泰興市一鳴生物制品有限公司，江蘇泰興 225433）

超聲波輔助酶法水解尋氏肌蛤蛋白

孔美蘭1，劉謀泉1，孔德虎2，袁秀霞1，林繼娜1，沈少游1，吳悅婷1

（1.韓山師范學院生物系，廣東潮州 521041；2.泰興市一鳴生物制品有限公司，江蘇泰興 225433）

摘 要：采用超聲波輔助中性蛋白酶水解尋氏肌蛤，以-氨基態氮含量為檢測指標。首先采用單因素和正交優化試驗L9（34）確定酶法水解薄殼肉蛋白的最適條件．研究結果為：pH6.5，水解時間5 h，溫度55℃，酶濃度2.0%，料液比1∶2，水解液的α-氨基態氮含量為0.372 6 g/100 mL。在此基礎上，研究功率300 W的超聲波預處理對酶解效果的影響，綜合考慮，采用超聲波預處理10 min，α-氨基態氮含量提高到0.394 1 g/100 mL。

關鍵詞：尋氏肌蛤；中性蛋白酶；超聲波；酶解

尋氏肌蛤（Musculus senhousei），俗稱薄殼，具有易養殖，生長快，產量大，價格低的特點。汕頭大學研究人員研究發現，薄殼蛋白質含量高達10.48%，比有“海洋牛奶”之稱的牡蠣還高出近一倍；組成氨基酸比例合理；礦物質含量明顯高于其他海洋貝類生物，尤其具有抗癌作用的元素硒含量很高，是一種優質動物蛋白資源[1]。

尋氏肌蛤在每年的5、6月份大量上市，主要用于鮮食，少量經粗加工成薄殼米出售或者作為優質海魚魚苗期飼料[2]。集中上市時，由于鮮食量有限，造成薄殼大量積壓，價格一再走低，導致養殖戶增產不增收。因此有必要進行薄殼深加工的研究。

由于尋氏肌蛤是潮汕地區的特有資源，所以目前對其加工利用方面的研究幾乎沒有。本研究對尋氏肌蛤蛋白通過酶解將大分子蛋白質降解為多肽、小肽及氨基酸，以利于人體的消化吸收，或者作為方便食品的海鮮調味料的主要原料，以及可以作為食品的營養強化劑，可大大提高其營養價值和商業價值，同時也有利于其貯存。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

尋氏肌蛤：購于潮州楓春水產批發市場；中性蛋白酶（南寧龐博生物技術有限公司，酶活力3 000 U/mg）；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器和設備

TD-5型臺式離心機：長沙英泰儀器有限公司；pH S-25型酸度計：上海偉業儀器廠；WFZUV-2102PC紫外分光光度計：尤尼柯（上海）上海儀器有限公司；SB-5200超聲波清洗機（300 W）：上海新芝生物技術研究所；JJ-2型組織搗碎機：江蘇省金壇市榮華儀器有限公司；控溫式磁力攪拌器：常州國華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

尋氏肌蛤→蒸煮→脫殼、取肉→稱量→調節pH→按比例加入酶→（超聲波處理）→在一定溫度下水解→滅酶（沸水浴10 min）→冷卻至室溫→離心10 min收集上清液→測定α-氨基態氮含量

（注：超聲波處理在酶解試驗的單因素和優化試驗中不做。）

1.3.2 分析檢測方法

蛋白酶活力的測定[3]：福林酚法；粗蛋白[4]：微量凱氏定氮法；氨基態氮含量[4]：甲醛滴定法。

1.3.3 試驗設計

1.3.3.1 單因素對中性蛋白酶酶解效果的影響

1）料液比對酶解效果的影響

分別采用料液比為 1∶ 1；1∶1. 5；1∶ 2；1∶2. 5；1∶3（g/mL），在 pH7.0，溫度 50℃，酶濃度為 1.0%，水解時間為6 h條件下進行酶解反應，研究料液比對酶解效果的影響。

2）酶濃度的影響

根據以上試驗，設定料液比為1∶2，在pH7.0，溫度50℃，改變酶濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，然后水解6 h，研究酶濃度對酶解效果的影響。

3）溫度對酶解效果的影響

根據以上試驗，設定中性蛋白酶酶濃度1.5%，料液比為 1∶2，pH7.0，分別于 40、45、50、55、60、65 ℃條件下水解時間6 h，研究溫度對水解度的影響。

4）pH對酶解效果的影響

根據以上試驗，設定中性蛋白酶酶濃度1.5%，料液比為 1∶2，溫度 55 ℃，分別在 pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等不同pH中進行酶解6 h，研究不同的pH對酶解效果的影響。

5）時間對酶解效果的影響

根據以上試驗，設定中性蛋白酶酶濃度1.5%，料液比為1∶2，溫度55℃，pH7.0，分別在水解時間為2、3、4、5、6、7、8 h 條件下進行酶解反應，研究酶解時間對水解效果的影響。

1.3.3.2 中性蛋白酶最佳工藝條件的確定[5]

根據以上單因素試驗結果，酶濃度、水解時間、水解溫度、體系pH以及料液比均對酶解效果有一定的影響?？紤]到酶解過程是受到以上各因素的綜合影響，因此進行L9（34）正交試驗，以確定其最佳酶解條件，其中料液比固定在1∶2。正交試驗因素水平表見表1。

表1 中性蛋白酶的正交試驗因素水平表Table 1 Level and factors of hydrolyzation of neutral proteinase

1.3.3.3 超聲波輻射對酶解效果的影響

在正交試驗的基礎上，研究額定功率300 W的超聲波預處理對后期蛋白質水解效果的影響。試驗采用超聲波清洗機對酶解前的料液分別作用10、20、30 min，接著在最佳條件下進行水解。

2 結果與分析

2.1 中性蛋白酶酶解條件單因素試驗結果

2.1.1 料液比對酶解效果的影響

料液比對酶解效果的影響，見圖1。

圖1 料液比對水解效果影響曲線Fig.1 Effect of ratio of solid and liquid on hydrolyzation

由圖1可知，隨著料液比值的降低，反應體系中的水分增加，α-氨基態氮的生成量逐漸升高，直至料液比為1∶2時達到最高，之后隨著料液比值的繼續下降，α-氨基態氮生成量下降。出現上述現象的原因是，隨著料液比的下降，反應體系中水分會增加，從而降低了反應產物的濃度，減輕了產物對反應的抑制作用。但是，隨著反應體系中水分的增加，酶的濃度相應的會下降影響了α-氨基態氮的進一步提高。因此選擇料液比為1∶2。

2.1.2 酶濃度的影響

酶濃度對水解效果的影響，見圖2。

圖2 酶濃度對水解效果影響曲線Fig.2 Effect of density of protease on hydrolyzation

由圖2可看出，隨著酶濃度的增加α-氨基酸態氮含量在不斷升高，當酶濃度超過1.5%繼續增加酶濃度時，α-氨基酸態氮含量增加不明顯。從節約成本考慮，將酶濃度設定為1.5%。

2.1.3 溫度對酶解效果的影響

溫度對酶解效果的影響，見圖3。

圖3 水解溫度對水解效果影響曲線Fig.3 Effect of temperature on hydrolyzation

由圖3可知：從溫度40℃升到55℃的過程，α-氨基態氮含量急劇增加；在超過55℃以后，隨溫度的上升，α-氨基態氮含量有所下降，分析原因可能是溫度過低，酶活比較低；而溫度過高則導致酶逐漸失活。因此選擇水解溫度為55℃。

2.1.4 pH對酶解效果的影響

pH對酶解效果的影響，見圖4。

圖4 pH對水解效果影響曲線Fig.4 Effect of pH on hydrolyzation

由圖4中可看出，pH5.0時α-氨基態氮含量相當低，表明蛋白酶在低pH值時作用不明顯。隨pH的升高，酶解產物中α-氨基態氮含量不斷升高。當pH處于7.0左右時候酶解效果最好，而當pH值超過8.0繼續升高時，α-氨基態氮含量反而下降。因此選擇pH7.0為最佳條件。

2.1.5 時間對酶解效果的影響

時間對酶解效果的影響，見圖5。

圖5 酶解時間對水解效果影響曲線Fig.5 Effect of time on hydrolyzation

由圖5可知，反應開始的2 h內，反應速度較慢，所以α-氨基態氮含量增加幅度較小；在2 h～5 h之間α-氨基態氮增加幅度有所增強；超過5 h之后α-氨基態氮基本上無變化，水解基本完成。此外，從節省能耗和防止水解液變質方面來考慮，控制反應的最佳時間在4 h～6 h之間。

2.2 中性蛋白酶最佳工藝條件的確定

表2 中性蛋白酶酶解條件L9（34）正交試驗設計與結果分析Table 2L9（43）orthogonal design and result of hydrolyzation of neutral proteinase

由表2可知，加酶量是影響水解效果的最主要因素，pH是次要因素，水解時間和溫度對酶解程度的影響較小。單從α－氨基態氮含量來考慮，最佳處理條件為 A2B1C2D3，即 55℃，pH6.5，加酶量 2.0%，水解時間為5 h。在此最適條件下水解，測定水解液的α－氨基態氮含量為0.372 6 g/100 mL＞0.349 5 g/100 mL（正交表中的最大值），說明正交試驗成功，結果可靠。

2.3 超聲波輻射對酶解的影響

朱國輝[6]等報道，超聲波在介質中傳播時，加速了介質中的質量傳遞作用。這有利于反應底物進入酶的催化部位及產物進入介質的傳質作用，從而表現出酶活性的增加。同時，適宜的聲場作用也會使蛋白酶分子的構象發生變化，使其折疊更合理，更容易與底物結合成中間產物，從而提高酶的催化活力。

圖6 超聲波預處理對蛋白水解效果的影響Fig.6 Effect of ultrasonic pretreatment on hydrolyzation

由圖6可知，經超聲波處理后，當超聲波作用時間在20 min內時，隨著作用時間的延長α－氨基態氮生成量增加；當作用時間在20 min至30 min之間時，隨著作用時間的延長α－氨基態氮生成量有所降低。這是由于，短時間的超聲波作用使內源蛋白酶組織發生了破裂，有利于酶與蛋白質的接觸，體現出作用后水解效果有所改善[6]。當超聲波作用達到一定能量水平時，破碎酶組織的同時進一步破壞了酶的內部結構而致使部分酶失活，起到一定的負作用。當這種負作用大于激活作用時，就會表現出α－氨基態氮生成量有所下降，表現出超聲波作用20 min的激活效果最好。由于超聲波10 min與20 min相比差距不大，從經濟角度考慮，采用超聲波10 min預處理，水解液中α－氨基態氮含量為0.394 1 g/100 mL。

3 結論

1）試驗采用中性蛋白酶對薄殼肉進行酶解，通過影響酶解效果的幾個因素進行單因素和優化試驗，最終得出薄殼肉蛋白水解的最佳條件為：pH6.5，水解時間5 h，溫度55℃，酶濃度2.0%，料液比1∶2，水解液的α－氨基態氮含量為0.372 6 g/100 mL。

2）為了進一步提高水解效果，在確定的最佳水解條件下，采用超聲波預處理激活內源酶的活力。試驗表現功率為300 W的超聲波作用20 min的激活效果最好，從節約能源角度考慮，最終采用超聲波10 min預處理，α－氨基態氮含量提高到0.394 1 g/100 mL，為進一步綜合利用提供了大量的氨基酸和小肽。

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[1]佘綱哲,傅明輝.尋氏肌蛤營養成分分析[J].海洋科學,1996(5):9－11

[2]蔡英亞.尋氏肌蛤的養殖和利用[J].水產與教育,1975(1):9－11

[3]王秀奇,親屬元,高天慧,等.生物化學實驗[M].北京:高等教育出版社,1990:177－180

[4]寧正祥.食品分析手冊[M].北京:中國輕工業出版社,1998:34－263

[5]鄧尚貴,章超樺.利用正交試驗優化貽貝水解工藝[J].水產學報,1997,21(2):220－224

[6]朱國輝,黃卓烈,徐鳳彩,等.超聲波對菠蘿果蛋白酶活性和光譜的影響[J].應用聲學,2003,22(6):10－14

Enzymolysis of Protein from Musculus Senhousei Assisted by Ultrasonic

KONG Mei-lan1，LIU Mou-quan1，KONG De-hu2，YUAN Xiu-xia1，LIN Ji-na1，SHEN Shao-you1，WU Yue-ting1
（1.Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China；2.Taixing Yiming Biological Products Co.，Ltd.，Taixing 225433，Jiangsu，China）

Abstract：Using enzymatic extraction methods assisted by ultrasonic to enzymolysisMusculus senhousei， αamino nitrogen content was the index.Firstly，the hydrolysis ofMusculus senhouseiby neutral proteinase through single element experiment and L9（34） orthogonal study were studied.The results showed that optimum hydrolysis conditions were：pH 6.5，hydrolysis time 5 h，temperature 55℃，content of enzyme 2.0%，the solid/liquid ratio was 1∶2.The content of α-amino acid was 0.372 6 g/100 mL.On this basis， we studied the effect of pretreatment on hydrolysis using ultrasonic of 300 W power.The results showed that 10 minters ultrasonic pretreatment can improve enzymolysis evidently and the content of α-amino acid was 0.394 1 g/100 mL.

Key words：Musculus senhousei； neutral proteinase； ultrasonic； enzymolysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.006

韓山師范學院青年基金項目（LQ200807）

孔美蘭（1977—），女（漢），講師，碩士，主要從事食品生物技術方面的研究。

2013－07－23