Rv0222/ESAT-6融合蛋白對結核病的診斷價值

張慧漲 范齊文 楊華 黃紅梅 方強

(1.復旦大學附屬金山醫院檢驗科，上海 201508；2.復旦大學附屬公共衛生臨床中心檢驗科，上海 201508；3.上海市肺科醫院結核病實驗室，上海 200433)

目前，結核病仍是人類面臨的最嚴重的傳染病之一。近年來，結核分枝桿菌多藥耐藥菌株(multidrug resistance，MDR)的增多及合并艾滋病等使結核病患者的病死率升高[1]。肺結核患者的診斷主要依據臨床表現、影像學檢查以及痰涂片查找抗酸桿菌等。痰涂片檢查結核分枝桿菌的陽性率偏低；結核分枝桿菌的培養一般需4～8周，陽性率也較低；常用的血清學診斷、結核分枝桿菌純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗等輔助診斷方法也有很多不足。結核分枝桿菌感染T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT.TB，簡稱T-SPOT)技術具有高特異度和靈敏度，已被國外廣泛應用于結核分枝桿菌潛伏感染的檢測[2]。但是，T-SPOT所需血液量較多，且需24 h才能完成。血清抗體檢測具有快速、簡便、價格低廉、非侵入性等優點，一直是結核病診斷的研究熱點。

本研究誘導Rv0222大量表達并純化，然后將其與ESAT-6結合成融合蛋白，以該融合蛋白為抗原采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清，評價其在臨床結核病及HIV合并結核病的早期診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年在復旦大學附屬公共衛生臨床中心就診的結核病患者42例(其中肺結核15例，肺外結核27例；男性24例，女性18例)以及HIV合并結核病患者36例(其中男性33例，女性3例)；選擇2013年在復旦大學附屬金山醫院就診的非結核疾病患者20例(其中乙型肝炎5例、肝硬化4例、肺炎7例、肺氣腫2例、尖銳濕疣2例；男性12例，女性8例)以及健康體檢者28名(其中男性16名，女性12名，根據臨床檢測和病史資料，排除心、肝、腎疾病及糖尿病、腫瘤等疾病)，小兒結核抗體陽性者48例(其中單獨IgG型38例，IgM和/或IgG型10例；年齡3個月～7歲；男性27名，女性21名)。收集各受試者的血液標本。

1.2 試劑與儀器 pMD18-T載體、聚合酶、內切酶、T4連接酶購自生物工程(大連)有限公司；His-Tag純化試劑盒購自美國Novagen公司；HRP標記羊抗人二抗購自美國Sigma公司；Taq酶、dNTP、Mg2+、緩沖液購自北京天根生化科技有限公司；結核分枝桿菌H37Rv標準菌株購自上海市肺科醫院；T-SPOT試劑盒購自英國Oxford Immunotec公司；結核抗體試劑購自北京健乃喜生物技術有限公司；酶標二抗稀釋液、顯色液A、顯色液B、終止液購自上海榮盛生物藥業有限公司。

1.3 PCR引物的設計與合成 Rv0222和早期分泌性靶抗原(early secretory antigenic target,ESAT-6)基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 Rv0222/ESAT-6融合蛋白的引物設計

1.4 基因克隆和鑒定 以H37Rv染色體DNA為模板分別擴增Rv0222和ESAT-6基因片段。Rv0222基因的PCR反應條件：94℃ 7 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃ 7 min。Rv0222基因的擴增產物經試劑盒處理后，裝入pMD18-T載體中；將載有Rv0222基因的pMD18-T酶切處理后，再亞克隆到表達載體pET28a，構建重組質粒pET28a-Rv0222。以同樣方式克隆ESAT-6基因。ESAT-6基因PCR反應條件：94℃ 7 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃ 7min。構建重組質粒pET28a-Rv0222-ESAT-6，挑選重組克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 重組融合蛋白的收集、純化和抗原性鑒定 挑重組菌，于含100 mg/L氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)培養基中過夜培養；再以1∶100接種到1 L的LB培養基中37℃培養，至吸光度(A)值為0.6～0.8；加入β-硫代半乳糖苷至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續培養4～6 h；超聲破菌后用8 mol/L尿素溶解，流過瓊脂糖鎳柱，得到高純度的重組蛋白。將純化變性的蛋白置于半透膜中，在4℃低溫磷酸緩沖液(PBS,pH7.4)中緩慢透析，使變性蛋白完全溶解。留取樣品，用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。純化蛋白全濕轉膜，350 mA，45 min。用含5%小牛血清的PBS封閉1 h，與1∶200稀釋的結核患者血清的一抗反應l h，充分洗滌后與1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人二抗反應2 h，四甲基聯本胺和雙氧水等反應顯色。

1.6 ELISA 以Rv0222/ESAT-6融合蛋白包被酶標板，采用ELISA檢測待測血清。根據棋盤滴定法選擇包被抗原濃度為4 μg/mL，每孔100 μL包板，4℃過夜，洗滌后用含1%牛血清白蛋白的PBS封閉1 h。取95 μL樣品稀釋液，加入Rv0222/ESAT-6抗原預包被板中，取5 μL待檢樣本加入樣品稀釋液中吹打混勻(1∶20稀釋)，37℃孵育1 h，同時設空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔。濃縮洗液以1∶20用蒸餾水稀釋后，加入300 μL/孔，洗板機洗板5次。于各反應孔中，加入用酶標二抗稀釋液新鮮稀釋的酶標抗體(1∶10000稀釋)100 μL。37℃孵育30 min。濃縮洗液以1∶20用蒸餾水稀釋后，加入300 μL/孔，洗板機洗板5次。顯色液A、B等體積混合后，于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100 μL ，室溫避光反應2～5 min。于各反應孔中加入終止液50 μL終止反應。在酶標儀上于450 nm/630 nm處檢測各孔OD值，若大于陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

1.7 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行分析，采用χ2檢驗比較結核患者、非結核患者和健康對照者的抗體陽性檢出率，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 T-SPOT檢測結果 42例結核患者中24例陽性，36例HIV合并結核患者中18例陽性，共42例陽性。20例非結核患者與28例健康體檢者均為陰性。

2.2 42例T-SPOT陽性患者的ELISA檢測結果 42例中，36例的ELISA結果為陽性，6例為陰性。ELISA與T-SPOT比較，總的陽性符合率為86%(36/42)，即ELISA的敏感性為86%。

78例結核與HIV合并結核患者的T-SPOT陽性率54%(42/78)，ELISA陽性率46%(36/78)，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 36例T-SPOT陰性的結核患者與HIV合并結核患者的ELISA檢測結果 見表2。

表2 36例T-SPOT陰性患者的ELISA檢測結果 (n)

ELISA與T-SPOT比較，總的陰性符合率75%(27/36)；36例T-SPOT陰性的患者中9例ELISA陽性，占25%(9/36)；其中有2例培養陽性而T-SPOT陰性的患者ELISA陽性。

2.4 各組的檢測結果比較 見表3。

表3 各組的檢測結果比較 (n)

結核患者：T-SPOT 陽性率57%(24/42)，ELISA陽性率71%(30/42)，差異有統計學意義(P<0.05)

HIV合并結核患者：T-SPOT陽性率50%(18/36)，ELISA陽性率61%(22/36)，差異無統計學意義(P>0.05)

非結核患者與健康體檢者的T-SPOT與ELISA結果均為陰性，表明ELISA的特異性為100%。

2.5 48例小兒結核抗體陽性者的ELISA檢測結果 48例小兒結核抗體陽性者中，所有的ELISA結果均為陰性。

3 討 論

1999年Behr等[3]比較Mtb(H34Rv株)和卡介苗基因組后發現了16個缺失區，RD4區是其中之一。RD區被認為與Mtb的毒性直接相關[4]，是導致卡介苗毒性減弱的主要原因，因此，RD區成為尋找結核病免疫學診斷抗原的方向之一。Rv0222是結核分枝桿菌H37Rv株中RD4位點enoyl-CoA hydratase echA1基因(789bp)編碼的蛋白，含262個氨基酸，分子量為27 280.2D，等電點為4.78。Rv0222可能是烯酰輔酶A水合酶，參與脂類代謝。編碼Rv0222的基因經研究[5-6]證實不存在于野生型的牛型分枝桿菌和BCG中，故該基因的檢測對于排除卡介苗接種者的假陽性較為有利，這與本研究中小兒因接種BCG而結核抗體陽性但ELISA結果均為陰性相符合。ESAT-6基因位于H37Rv菌株中RD1位點，含96個氨基酸，分子量為6000 D，由于ESAT-6僅在致病性分枝桿菌(如人結核分枝桿菌、 牛分枝桿菌、 非洲分枝桿菌、薩斯分枝桿菌、 瘰疬分枝桿菌、 蘇爾加分枝桿菌、 微黃分枝桿菌)中表達 ,特異性強；其在所有BCG亞株和非致病分枝桿菌中均不表達。許多研究表明，ESAT-6蛋白具有良好的抗原刺激性并能被大多數結核患者所識別。

根據Rv0222與ESAT-6的生物學特性，預期以Rv0222/ESAT-6融合蛋白作為抗原診斷結核分枝桿菌感染，將會有較高的特異性和敏感性，在結核病的早期診斷上可能有優勢。Rosenkrands等[5]對比了Rv0222蛋白與ESAT-6/CFP10融合蛋白(T-SOPT.TB的診斷抗原)對結核感染的診斷效果，二者的敏感性分別為94%、75%。本研究中對于結核患者，ESAT-6/CFP10融合蛋白和Rv0222/ESAT-6融合蛋白診斷結核感染的敏感性分別為57%、71%，證實Rv0222/ESAT-6融合蛋白是血清學診斷結核的一個有前景的抗原靶標。Rosenkrands等[5]發現，Rv0222檢測HIV陽性的結核感染者的敏感性(43%)高于HIV陰性的結核感染者(30%)；ESAT-6/CFP10融合蛋白檢測這兩類人群結核感染的敏感性分別為10%、42%。本研究中，對于HIV陽性的結核患者，Rv0222/ESAT-6融合蛋白和ESAT-6/CFP10融合蛋白的相對檢出率分別為61%、50%，這表明Rv0222/ESAT-6融合蛋白對于診斷HIV陽性者的結核感染有較高的敏感性。

綜上所述，以Rv0222/ESAT-6融合蛋白作為抗原的ELISA用于診斷結核感染的靈敏度和特異性均較高，同時對于合并HIV感染的結核診斷也有較高的檢出率。由于ELISA法具有快速、簡便、無需特殊儀器的優點，克服了結核病傳統檢測方法的檢測周期長、步驟繁瑣、影響因素多、需特殊儀器等缺點。Rv0222/ESAT-6融合蛋白作為診斷抗原的ELISA檢測在結核病的早期檢測、早期診斷方面具有潛在的應用價值。

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