小片段干擾RNA抑制人肝癌細胞株中YAP基因表達的研究

張素青 陳櫞 張一心 劉繼斌 朱燁菁 錢俊 李德春

(1.蘇州大學附屬第一醫院普外科，江蘇蘇州 215006；2.江蘇省南通市腫瘤醫院普外科，江蘇南通 226361；3.南通大學臨床醫學系，江蘇南通 226019)

目前認為，癌基因的激活與腫瘤發病密切相關，阻斷癌基因的高表達可以防止正常細胞癌變，甚至可使惡性腫瘤細胞轉為正常細胞[1]。YAP(yes-associated protein)是一種癌基因，其通過Hippo通路促進細胞凋亡，進而導致細胞接觸性抑制的喪失，促進細胞癌變[2]。之前，我們的研究認為，抑制YAP的表達可望提高化療藥物治療腫瘤的療效。本研究則利用小片段干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)來抑制YAP基因表達以觀察肝癌細胞株對阿霉素(adriamycin，ADM)的敏感性變化。

1 資料與方法

1.1 細胞株和試劑 肝癌細胞株Huh-7、PLC/PRF/5、MHCC 97H、MHCC 97L購自中國科學院上海細胞生物學研究所。脂質體LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM培養液、ADM、四甲基偶氮唑藍(methyl thialzolyl tetrazolium，MTT)及二甲基亞砜、蛋白免疫印跡(Western blotting)試劑盒、標準蛋白均由上海睿智化學研究有限公司提供。兔抗人YAP一抗購自美國ImmunoWay公司。羊抗兔二抗購自北京中衫金橋生物技術有限公司。siRNA序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列的設計 參照文獻[3]采用在線設計軟件設計并篩選出了針對YAP基因啟動子區域的siRNA序列。上游引物：5′-GACGACCAAUAGCUCAGAUTT-3′，下游引物：5′-UCUGAGCUAUUGGUC GUCTT-3′。

1.2.2 細胞培養及瞬時轉染 肝癌細胞株Huh-7、PLC/PRF/5、MHCC 97H、MHCC 97L用10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37℃、CO2體積分數為5%的條件下中培養3 d，定期觀察細胞的生長情況，培養3 d時用胰酶消化并傳代。消化Huh-7、PLC/PRF/5、MHCC 97H、MHCC 97L細胞后接種于24孔培養板中繼續培養，待細胞融合度為70%時，換為無血清培養液，并按脂質體Lipofecta-mineTM 2000的說明書將siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4分別轉染肝癌細胞株，同時設立不轉染siRNA的空白組、熒光標記組、對照組(NC組)。轉染4 h后，換為DMEM完全培養液培養，24 h后用于熒光顯微鏡下觀察轉染效果。48 h后收集轉染效率最高的細胞，提取蛋白；采用蛋白免疫印跡(Western blotting)法檢測YAP的表達。

1.2.3 MTT比色法檢測細胞的存活率 按每孔5000個細胞的密度接種于96孔板中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養24 h，然后按脂質體Lipofectamine TM 2000的說明書以siRNA瞬時轉染，轉染4 h后加入不同濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μg/mL)的ADM，繼續培養48 h后每孔加入MTT液10 μL繼續培養4 h，然后每孔加入三聯溶解液(10%SDS，5%異丁醇，0.01 mol/L HCl)100 μL過夜，測定各孔在波長560 nm/700 nm處的光密度(A)值。空白對照組的孔中加入等量DMEM培養液代替ADM/siRNA，每組培養的細胞均重復3個孔。根據公式計算細胞的存活率：細胞存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行統計學處理，組間比較采用t檢驗，免疫組織化學染色結果的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 siRNA轉染對肝癌細胞株生物學特性的影響 siRNA轉染24 h后，4種肝癌細胞均縮小，大小不等，胞質凝縮，細胞增殖受到抑制；而對照組細胞無明顯變化。見圖1。

(見轉續)

(續圖1)

左側為空白對照組，中間為siRNA轉染組，右側為轉染后熒光顯微鏡下表現

2.2 Western blotting檢測siRNA轉染48 h后的YAP表達水平 用siRNA轉染Huh-7、PLC/PRF/5、MHCC 97H、MHCC 97L后與相應的對照組(NC組)進行比較，YAP的表達減少。見圖2。

2.3 MTT比色法檢測肝癌細胞的存活率 各肝癌細胞株均以siRNA轉染，轉染4 h后給予ADM。結果顯示，siRNA轉染組存活率明顯低于對照組(P<0.05)。見圖3。

1：NC組；2：Huh-7-siRNA組；3：PLC/PRF/5-siRNA組；4：MHCC 97H-siRNA組；5：MHCC 97L-siRNA組

轉染siRNA-3的肝癌細胞株即轉染組與空白對照組比較，*P<0.05，***P<0.01

3 討 論

一般認為，YAP在腫瘤的發生發展中起重要作用。YAP除了通過Hippo通路促進細胞癌變外[4]，還有研究[5]認為，YAP具有轉錄激活因子的功能，通過結合轉錄因子(p73、TEAD等)調節下游基因轉錄，從而影響細胞的凋亡、增殖和侵襲等生物學行為。Overholtzer等[6]研究發現，正常的乳腺上皮細胞可因YAP高表達而過度增殖，發生上皮-間質轉化，體外培養時呈現錨定非依賴性生長

Da等[7]對98例胃癌患者的研究發現，YAP表達陽性率為48%，且YAP的表達與凋亡抑制蛋白Survivin表達呈正相關。Bai等[8]也得出類似結論。Sudol等[2]的研究發現，YAP與肝癌患者的甲胎蛋白水平密切相關。

化療是中晚期無手術指征的肝癌患者的主要治療手段。ADM是常用的肝癌化療藥物，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA合成的抑制作用尤為顯著。術后的肝癌患者通常對ADM的敏感度低，另外，肝癌對ADM等化療藥物的耐藥性一直是個未解決的問題。

本研究針對YAP基因的啟動子區域設計并合成siRNA序列，篩選抑制效果較好的siRNA進行實驗。用熒光顯微鏡觀察和Western blotting法檢測發現，轉染siRNA后給予ADM處理的肝癌細胞存活率明顯低于未轉染siRNA組，表明siRNA抑制YAP表達可增強肝癌細胞株對ADM的敏感性。

綜上所述，本研究證實，siRNA干擾YAP表達后，肝癌細胞株對ADM敏感性增強，這為應用YAP抑制劑逆轉肝癌的耐藥性提供了依據。

[1]Carneiro F,Oliveira C,Leite M,et al.Molecular targets and biological modifiers in gastric cancer[J].Semin Diagn Pathol,2008,25(4):274-287.

[2]Sudol M.Yes-associated protein(YAP65) is a proline-rich phosphoprotein that binds to the SH3 domain of the Yes proto-oncogene product[J].Oncogene,1994,9(8):2145-2152.

[3]Xu MZ,Yao TJ,Lee NP,et al.Yes-associated protein is an independent prognostic marker in hepatocellular carcinoma[J].Cancer,2009,115(19):4576-4585.

[4]Zhao B,Wei X,Li W,et al.Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control[J].Genes Dev,2007,21(21):2747-2761.

[5]Liu AM,Xu MZ,Chen J,et al.Targeting YAP and Hippo signaling pathway in liver cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2010,14(8):855-868.

[6]Overholtzer M,Zhang J,Smolen GA,et al.Transforming properties of YAP,a candidate oncogene on the chromosome 11q22 amplicon[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(33):12405-12410.

[7]Da CL,Xin Y,Zhao J,et al.Significance and relationship between Yes-associated protein and survivin expression in gastric carcinoma and precancerous lesions[J].World J Gastroenterol,2009,15(32):4055-4061.

[8]Bai HB,Gayyed MF,Lam-Himlin DM,et al.Expression of Yes-associated protein modulates Survivin expression in primary liver malignancies[J].Hum Pathol,2012,43(9):1376-1385.