MiR-503逆轉肺癌耐藥細胞株A549/DDP的耐藥性及其機制研究

武毅 郭麗麗 劉京豪 劉仁旺 劉明輝 陳軍

肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，每年肺癌造成大約560,000死亡，其中一半來自中國[1]。由于起病隱匿，早期少有癥狀或癥狀不明顯，大多數肺癌患者在確診時往往已到了晚期。近年來，由于治療方案的不斷優化，以及靶向藥物的投入使用，肺癌的治療現狀已經得到了明顯的改善，但仍然存在一些急需解決的問題，例如腫瘤細胞對藥物的耐受性[2]。順鉑通過靶向DNA和拓撲異構酶II（Topo II），抑制DNA的合成和轉錄，誘導細胞凋亡，最終阻止腫瘤細胞生長[3]。在臨床運用過程中，肺癌細胞往往發展出對順鉑的耐藥性，使得藥效明顯下降。因此，探討腫瘤細胞的耐藥機制，開發新的逆轉耐藥性的方法，對提高臨床患者的受益有十分重要的意義。已有的研究[4-7]發現，腫瘤細胞產生耐藥的機制包括減少藥物的吸收，通過ABC（ATP-binding cassette）轉運蛋白增加藥物的外排，通過谷胱甘肽系統增加對抗腫瘤藥物的解毒作用，凋亡途徑異常減少腫瘤細胞的凋亡[4-7]。

MiRNAs是一類內源性的不編碼蛋白的小RNAs，長度一般為18個-24個核苷酸，可通過與目標mRNA的互補序列相結合，在后轉錄水平對基因的表達進行調控，導致目標mRNA的降解或者基因沉默[8]。很多研究[9,10]已經提供了特異性miRNAs的表達與腫瘤密切相關的證據，這些研究清楚的展現出一個單獨的miRNA可通過其調控的目標基因，對多種與腫瘤細胞失控生長、抗凋亡、遷移和侵襲，甚至是腫瘤細胞對藥物治療的應答產生調控作用。

最近，miRNA-503（miR-503）在癌癥中的作用備受關注。研究發現miR-503在口腔癌和肝細胞癌中的表達下調[11,12]，但在甲狀旁腺癌和腎上腺皮質癌中卻過表達[13,14]。并且，在腎上腺癌中，miR-503上調與患者的總體生存期縮短有關[13]。在肝癌細胞系HCCLM3中，miR-503則可誘導細胞停滯于G1期并抑制細胞的遷移和侵襲[11]。然而，miR-503在肺癌耐藥性中的作用尚無太多的研究。

在本研究中，我們發現miR-503的高表達可以逆轉A549/DDP的耐藥性，抑制該細胞的生長并促進其凋亡。我們的結果說明miR-503在肺癌順鉑耐藥中發揮重要作用，其機制可能是通過調控多種與耐藥相關蛋白，細胞增殖相關蛋白和凋亡相關蛋白等有關。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人肺癌細胞系A549和A549/DDP購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；細胞培養基購自Gibco；可穩定表達miR-503的miR-503 precursor質粒（pre-miR-503）及其陰性對照質粒購自Invitrogen；TaqMan MicroRNA assay kit購自Applied Biosystems；Lipofectamine 2000購自Gibco；MTS、Rh-123、RT-PCR試劑盒，pGL4.74[hRluc/TK]質粒，pGL4.32(luc2P/NF-κBRE/Hygro)質粒，pGL 4.44[luc2P/AP1 RE/Hygro]和Dual-GloTM Luciferase assay system均購自Promega公司；細胞凋亡流式檢測試劑盒購自BD biosciences；單克隆抗體購自Santa Cruz公司；ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore；順鉑購自Sigma公司；流式細胞儀：BD公司，酶標儀：Thermo，PCR儀：Thermo。

1.2 細胞培養與miR-503轉染 A549和A549/DDP細胞培養于10 cm培養皿，37oC、5% CO2、飽和濕度的培養箱中，培養基為90% EMEM，10%胎牛血清。0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有試驗均采用對數生長期細胞。將A549/DDP細胞暴露于底劑量［1/10的半數抑制濃度（50%concentration of inhibition, IC50）］的順鉑中維持細胞耐藥性。

A549/DDP培養于10 cm培養皿中，待其達到約80%融合時，按照試劑盒說明書的操作方法，加入100 nmol/L pre-miR-503質粒或者陰性對照質粒進行轉染，繼續培養48 h。傳代培養后，取細胞裂解后，用TaqMan MicroRNA assay kit進行Q-PCR實驗，定量檢測miR-503，以評估premiR-503的轉染效果。

1.3 MTS法檢測miR-503對細胞耐藥性的作用 取對數生長期的細胞，以2×104/mL接種到96孔微孔板中，100 μL/孔，培養過夜使細胞貼壁。向對應試驗孔加入不同濃度的順鉑，繼續培養72 h，吸去培養基，加入100 μL含0.5 mg/mL MTS的RPMI-1640，繼續培養4 h。最后用酶標儀測定490 nm波長下的光密度（optical density, OD）值，并計算藥物對細胞的抑制率。抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以順鉑濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖并擬合抑制曲線，求得IC50值。逆轉倍數（reversal fold, RF）= IC50（無miR-503）/IC50（有miR-503）。

1.4 流式細胞術檢測A549/DDP細胞內Rh-123含量及細胞凋亡 取對數生長期的經pre-miR-503質粒轉染的A549/DDP細胞，加入10 μmol/L Rh-123染液，培養1 h后收集細胞，調整細胞濃度至106/mL，用流式細胞儀檢測細胞中Rh-123的熒光強度（488 nm激發光，560 nm發射光），以此檢測細胞中Rh-123的含量。細胞凋亡采用PI/Annexin V-FITC雙染法，均根據試劑盒說明書操作。以陰性對照質粒轉染的腫瘤細胞作為對照。

1.5 Western blot法檢測A549/DDP細胞中多種蛋白的表達取對數生長期的經pre-miR-503轉染的A549/DDP細胞，收集細胞裂解提取蛋白。BCA法測定細胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質以12% SDS-PAGE法分離并轉移至PVDF膜上，以單克隆抗體4oC過夜孵育以檢測目標蛋白。洗去一抗，以HRP連接的二抗于室溫孵育2 h，洗滌后以ECL試劑盒顯示免疫印跡條帶。α-tubulin作為內參。

1.6 Real-time PCR檢測A549/DDP腫瘤細胞中多種蛋白基因的mRNA水平 取對數生長期的經pre-miR-503轉染的A549/DDP細胞，用Trizol法提取各組總RNA，用Real-time PCR試劑盒進行逆轉錄得到cDNA。MDR1上游引物序列：5'-AAAAAGATCAACTCGTACCACTC-3'，下游引物序列：5'-GCACAAAATACACCAACAA-3'；MRP1上游引物序列5′-ACTTCCACATCTGCTTCGTCAGT-3，下游引物序列：5′-ATTCAGCCACAGGAGGTAGAGAGC-3′；ERCC1上游引物序列：5′-GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3′，下游引物序列：5′-GCGGAGGCT-GAGGAACAG -3′；RhoE上游引物序列：5′-CCTCCACGTTGATTCGACTGTT-3′，下游引物序列：5′-TGTAAAAGCCG-TACGTTGCGGT-3′；Survivin上游引物序列：5′-GCATGGGTGCCCCGACGTT G-3′，下游引物序列： 5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′；Bcl-2上游引物序列：5′-ACGGGGTGAACTG GGGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-TGTTTGGGG CAGGCATGTTGACTT-3′；β-actin上游引物序列：5′-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3′，下游引物序列：5′-TC CTTAATGTCACGCACGATTT-3′；94oC變性3 min后，按下述條件擴增36個循環：95oC 15 s，65oC 30 s，72oC 95 s，72oC延伸5 min。

1.7 數據統計 實驗數據以Mean±SD表示，使用SPSS 13.0軟件進行分析。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行比較，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建miR-503高表達的A549/DDP 如圖1所示，與對照組（A549/DDP細胞中轉染空載質粒）和未處理的原發A549/DDP細胞相比較，pre-miR-503轉染的A549/DDP細胞中，miR-503的表達水平明顯上升，這一結果說明miR-503高表達的A549/DDP構建成功。

圖 1 MiR-503在人肺癌細胞系中的表達。在A549/DDP細胞中轉染premiR-503質粒48 h后，利用TaqMan MicroRNA分析試劑盒，通過Q-PCR檢測miR-503的表達水平。未處理組：A549/DDP細胞；對照組：轉染空白對照質粒的A549/DDP細胞；miR-503組：轉染pre-miR-503質粒的A549/DDP細胞。實驗數據以均數±標準差表示，n=10，*表示與對照組相比，P＜0.05。Fig 1 The expression of miR-503 in human lung cancer cell lines. After transfection pre-miR-503 plasmids into A549/DDP cells for 48 h, the expression of miR-503 was detected by Q-PCR using TaqMan MicroRNA assay kit. Untreated group: the primary A549/DDP cells; Control group:A549/DDP cells transfected with control blank vector; miR-503 group:A549/DDP cell transfected with pre-miR-503 plasmids. Data was represented as Mean±SD, n=10, bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05).

2.2 轉染miR-503可逆轉A549/DDP的耐藥性，提高胞內Rh-123濃度，促進細胞凋亡 實驗結果顯示，與對照組相比較，pre-miR-503轉染的細胞對順鉑的敏感性明顯增加，pre-miR-503組IC50為17.6 μM，其逆轉系數是對照組（IC50為43.7 μM）的2.48倍；進一步研究發現miR-503轉染組細胞吸收熒光染料Rh-123的能力較對照組提高了2.49倍，細胞凋亡率是對照組的10.3倍 (圖2)。而且這些變化均與miR-503轉染構成量效關系。

圖 2 A549/DDP細胞中miR-503對藥物敏感性，Rh-123的胞內濃度及細胞凋亡的作用。A：MTS法結果顯示與對照組相比，轉染pre-miR-503后，細胞對順鉑的敏感性明顯增加，數據以Mean±SD表示，n=10，*表示與對照組相比，P＜0.05；B：流式細胞術結果表明與對照組相比，轉染pre-miR-503后，細胞內Rh-123的濃度增加，數據以Mean±SD表示，n=10，*表示與對照組相比，P＜0.05；C：流式細胞術結果表明與對照組相比，轉染pre-miR-503后，細胞凋亡數目增加，數據以Mean±SD表示，n=10，*表示與對照組相比，P＜0.05。Fig 2 The effect of miR-503 on drug sensitivity, intracellular level of Rh-123 and apoptosis in A549/DDP cells. A: The MTS assay indicated that the DDP-sensitivity in pre-miR-503 group was significantly increased while compared to the control group. Data was represented as Mean±SD, n=10,bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05); B: The flow cytometry assay results showed that there was an increased intracellular level of Rh-123 in pre-miR-503 group compared with control group. Data was represented as Mean±SD, n=10, bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05); C: The flow cytometry assay results showed that there was an increased apoptosis in pre-miR-503 group compared with control group. Data was represented as Mean±SD, n=10, bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05).

2.3 MiR-503下調MDR1、MRP1、ERCC1、Survivin和Bcl-2的表達，上調RhoE的表達 為了進一步探討miR-503逆轉A549/DDP耐藥性，促進腫瘤細胞凋亡的可能分子機制，我們分析了多種與耐藥相關基因的表達變化情況。Western blot檢測結果顯示，與對照組相比較，premiR-503轉染組細胞中MDR1和MRP1這兩個多藥耐藥基因和與DNA損傷修復相關基因ERCC1的蛋白的表達水平均明顯下調。此外，與腫瘤凋亡抑制相關的Survivin和Bcl-2的蛋白表達亦同時明顯下調。有趣的是，miR-503上調了RhoE蛋白的表達水平（圖3）。進一步應用RT-PCR檢測顯示，在pre-miR-503轉染組細胞中，MDR1、MRP1、ERCCI、Survivin和Bcl-2等基因的mRNA表達水平明顯下調，僅分別是對照組的18.5%、22.3%、18.6%、42.8%和68.1%（P＜0.05），而RhoE mRNA表達則是對照組的206.5%，明顯升高（P＜0.05）。這些結果表明miR-503對上述基因表達的調控是通過轉錄水平實現的。

2.4 MiR-503抑制Akt的磷酸化 為了研究miR-503逆轉A549/DDP耐藥性的分子機制，我們重點研究了PI3K/Ak通路。Western blot顯示，pre-miR-503轉染后，Akt的磷酸化水平下降，說明PI3K/Akt信號通路受抑制（圖4）。

3 討論

腫瘤細胞增加藥物的外排，減少藥物的吸收是其耐受化療藥物的一種主要手段。ABC家族的跨膜轉運蛋白，例如MDR1和MRP1，可將藥物從細胞內測泵到外側，在耐藥的腫瘤細胞中經常過表達[15]。Pre-miR-503轉染后，流式細胞術檢測可見細胞內Rhodamin-123的含量升高，間接說明miR-503逆轉A549/DDP的耐藥性與減少藥物的外排有關。進一步的研究發現，miR-503下調了MDR1和MRP1蛋白水平與mRNA水平的表達，為上述假設提供了佐證。

圖 3 A549/DDP細胞中轉染pre-miR-503后，耐藥相關基因的蛋白表達水平。Western blot結果顯示，與對照組相比，MDR1、MRP1、ERCC1、Survivin和Bcl-2的蛋白水平明顯降低，而RhoE的蛋白水平明顯增加，α-tubulin為內參。Fig 3 The expression of different drug-resistance related genes in A549/DDP cells transfected with pre-miR-503. Compared to the control group, the expression of MDR1,MRP1, ERCC1, Survivin and Bcl-2 were dramatically down-regulated while the expression of RhoE was significantly up-regulated in pre-miR-503 group by western blot assay. α-tubulin was used as an internal control.

圖 4 MiR-503對Akt磷酸化水平的影響。Western blot結果顯示，與對照組相比，轉染pre-miR-503質粒后，Akt磷酸化水平降低，α-tubulin為內參。Fig 4 The effect of miR-503 on phosphorylation of Akt in human lung cancer cell lines.Western blot assay showed that the phosphorylation of Akt was downregulated in premiR-503 group compared with control group. α-tubulin was used as an internal control.

除了MDR1和MRP1，其他分子也可能參與腫瘤細胞耐受順鉑有關。ERCC1可以修復化療藥物造成的DNA損壞[16-18]，因此它的表達水平很可能與A549/DDP的耐藥性有關。Western blot顯示，A549/DDP細胞中ERCC1具有較高的表達，而pre-miR-503處理后其表達水平明顯下降，并且這種下降與mRNA的下調有關。RhoE是一個非典型的RhoGTPase家族成員，它一直處于活化的GTP結合狀態，最近發現其在一些主要的肺癌細胞系和癌組織中的表達下調，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[19]。在本研究中，miR-503可上調RhoE的表達水平，可能對腫瘤起到抑制的作用。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織中，它可抑制腫瘤細胞的凋亡，促進增殖和血管新生，因此被認為是一個具有很高價值的腫瘤治療靶點[20,21]。實驗結果顯示，miR-503可下調Survivin表達，這與miR-503增加腫瘤細胞的凋亡率相匹配。Bcl-2是一個在細胞凋亡中發揮重要作用的蛋白，可抑制腫瘤細胞的凋亡，在很多腫瘤中發現Bcl-2的高表達與腫瘤的耐藥密切相關[22,23]。已有研究[24]顯示，在非小細胞耐順鉑細胞系A549/CDDP中，miR-503可以下調Bcl-2的表達，逆轉腫瘤的耐藥性。本研究發現，在A549/DDP細胞中，Bcl-2的蛋白表達水平明顯升高，說明Bcl-2介導的抗凋亡是腫瘤產生耐藥的主要機制之一。而premiR-503轉染可使A549/DDP細胞Bcl-2的表達明顯下降，這與流式觀察到的細胞凋亡率上升一致，是miR-503逆轉腫瘤耐藥性的重要機制之一。

本研究發現，miR-503對細胞耐藥性逆轉起著重要調節作用的信號通路是PI3K/Akt[25-27]，miR-503可抑制Akt的磷酸化，抑制PI3K/Akt信號通路的活性，從而抑制腫瘤細胞的增殖，逆轉其抗藥性，雖然具體的機制有待進一步的研究，但這種負調控可能是miR-503逆轉A549/DDP耐藥性的手段之一。