藏藥濕生扁蕾對人結腸癌細胞SW480增殖調控因子CyclinD1、CDK4、PCNA和p21kip1·mRNA表達的影響

1.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省武威腫瘤醫院，甘肅 武威 733000

藏藥濕生扁蕾對人結腸癌細胞SW480增殖調控因子CyclinD1、CDK4、PCNA和p21kip1·mRNA表達的影響

王雅莉1*景明1，2*張艷霞1，2陳正君1高娜1趙慧巧1劉娟娟1蘇永春3

1.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省武威腫瘤醫院，甘肅 武威 733000

目的探討藏藥濕生扁蕾對人結腸癌細胞SW480增殖調控因子CyclinD1、CDK4、PCNA和p21kip1·mRNA表達的影響。方法將SW480細胞接種于6孔培養板，24h后分別用不同濃度(0.25、0.50、1.00 mg/ml)的濕生扁蕾干預，繼續培養24h，提取每組總RNA，以GAPDH基因為內參，采用RT-PCR法檢測CyclinD1、CDK4、PCNA及p21kip1的mRNA表達水平。結果PCNA、CyclinD1及CDK4的mRNA表達隨濕生扁蕾濃度增加而減少，而p21kip1mRNA的表達隨濕生扁蕾濃度增加而增加，并呈現明顯的劑量依賴關系。結論藏藥濕生扁蕾干預SW480細胞的增殖與其抑制CyclinD1、CDK4、PCNA的表達和促進p21kip1的表達作用有關。

藏藥濕生扁蕾；結腸癌SW480細胞；增殖調控因子

結直腸癌(ColoreetalCarcinom，CRC)是當今世界上最常見的惡性腫瘤之一。在西方發達國家，其發病率高居惡性腫瘤的第2位。隨著經濟的發展和人均壽命的延長、生活方式和膳食結構的改變，我國結直腸癌的發病率也明顯上升，每年新增病例己超過17萬，尤其在天津、上海等大城市更為突出，男性高居第3位，女性僅次于乳腺癌而居第2位[1、2]。且其發病遞增速度已達世界均數的兩倍，我國已全面進入結直腸癌高發地區行列。如何有效的預防和治療CRC，成為醫學界高度關注的重要課題之一。此病在臨床治療方面，雖然以手術、藥物為基礎的聯合化療、放療等治療手段為患者帶來了希望。但治療過程中常用的化療藥普遍存在價格高、毒副作用大的缺點。因此，尋找、研制高效、低毒的藥物就成為目前CRC治療中迫待解決的問題。

藏藥濕生扁蕾(GentianopsispaludosaMa)為藏族民間常用草藥，為1年生草本，分布于青海海北、黃南、玉樹等地區。具有消熱、解毒和利濕消黃等功效[3]。近年來倍受關注。目前，有關其化學成分及臨床應用已經成為研究重點，且多集中在其有效成分的分離、提取、藥理作用等方面。由于其重要的藥用價值，開發利用有著廣闊的市場前景。濕生扁蕾現已在甘肅、青海作為重要藏藥進行深度開發[4]。

前期研究發現，藏藥濕生扁蕾的提取物可抑制人結腸癌細胞SW480的增殖，并誘導其凋亡。本研究觀察了濕生扁蕾對SW480細胞增殖調控因子CyclinD1、CDK4、PCNA及p21kip1表達的影響，探討藏藥濕生扁蕾干預SW480細胞增殖的分子機制，為結腸癌的治療和新藥開發開拓思路。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料①藥物：藏藥濕生扁蕾提取物(GTP，由甘肅中醫學院科研實驗中心提供)，規格10g原藥材/1g提取物浸膏；②細胞：結腸癌SW480細胞株)，購自齊氏生物科技有限公司；③主要試劑：DMEM培養基(Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶(trypsin，Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)， PBS(磷酸鹽緩沖液，Hyclone公司)，二甲亞砜(DMSO，Gibco公司)，RT試劑盒(Promega公司)，Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，PCR試劑盒(Promega公司)，Taq聚合酶(TaKaRa公司)，PCR引物(上海英俊生物有限公司)；④主要儀器：超凈工作臺(蘇州凈化設備公司)，二氧化碳培養箱、5417R高速冷凍離心機(德國Heraeus公司)，9600型PCR儀(美國PE公司)，Gel DOC 2000 型凝膠成像分析系統、APC 300型電泳儀和水平式電泳槽(美國Bio-Rad公司)，DU-650型蛋白核酸分析儀(美國Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 SW480細胞的培養 采用常規培養SW480細胞，培養液為含有10%小牛血清及青、鏈霉素各100u/ml DMEM液，在37℃，飽和濕度，5%CO2孵箱中培養，細胞單層貼壁生長至 80%左右融合時，以0.25%胰蛋白酶/EDTA消化后傳代培養。

1.2.2 SW480細胞分組 處于對數生長期的細胞分成以下4組：空白對照組(加等體積的PBS)、濕生扁蕾低劑量組(0.25mg/ml)、濕生扁蕾中劑量組(0.5mg/ml)和濕生扁蕾高劑量組(1.0mg/ml)。

1.2.3 RT-PCR檢測CyclinD1、CDK4、PCNA及p21的mRNA的表達水平 SW480細胞經胰酶消化后，接種于6孔培養板，細胞數約為2×105個/孔，24h后分別以不同濃度的濕生扁蕾干預，培養24h后，提取每組總RNA。

1.2.3.1 細胞總RNA的提取 按照Trizol試劑盒操作說明方法進行，隨后取2μgRNA按照逆轉錄反應試劑盒要求配制反應體系進行反轉錄，反轉錄后產物置于-20℃保存，用于PCR擴增。

1.2.3.2 目的基因PCR擴增 在NCBI上查目的基因全序列，利用Premier5.0軟件設計引物序列。CyclinD1：F:5′-TGG ATG CTG GAG GTC TGC GAG GAA -3′，R:5′-GGC TTC GAT CTG CTC CTG GCA GGC-3′；CDK4：F:5′-CAT GTA GAC CAG GAC CTA AGC-3′，R:5′-AAC TGG CGC ATC AGA TCC TAG-3′；PCNA：F:5′-GCT GAC ATG GGA CAC TTA-3′，R:5′-CTC AGG TAC AAA CTT GGT G-3′；p21kip1：F:5′-GCG ACT GTG ATG CGC TAA TGG-3′，R:5′-TAG AAA TCT GTC ATG CTG GTC TGC-3′；GAPDH：F:5′- CG ACC ACT TTG TCA AGC TCA-3′，R:5′- AG GGG TCT ACA TGG CAA CTG-3′。取cDNA 1.0?l，加10×Taq Buffer 2.0?l，25 mM Mg2+1.2μl，10 mM dNTP0.4μl，上下游引物各0.4?l，1U/mlTaq酶0.6μl，DEPC水14.0μl配成20μl的總反應體積。在95℃預變性3min，94℃40s，55℃40s，72℃45s，35個循環，72℃10min。擴增產物 4℃保存，用于瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3.3 PCR產物表達 取PCR擴增產物10μl，加2μl的loading buffer(6×)充分混勻后，加到1.5%瓊脂糖凝膠上樣孔中，通電，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿時停止電泳。

2 結果

SW480細胞經不同濃度濕生扁蕾提取物作用24 h后，CyclinD1、CDK4、PCNA mRNA的表達隨藥物濃度增加而減少，而p21kip1m RNA表達隨藥物濃度增加而增多，并呈現明顯的劑量依賴關系。見圖1。

圖1 濕生扁蕾對SW480細胞Cyclin D1、CDK4、PCNA和p21kip1的mRNA表達的電泳圖(內參GAPDH)

3 討論

適度的細胞增殖和凋亡是維持細胞群體數量穩定的重要條件，其調控錯綜復雜，受到細胞內、外多種因素和環節的影響，其中任何一個環節發生障礙，都可導致疾病的發生。腫瘤的發生主要特點是細胞凋亡不足，增殖過度，細胞群體穩態被破壞，導致病變細胞異常增多，病變組織器官體積增大，功能異常[5]。

CDK是細胞周期運轉的驅動力量之一，其激活依賴于與Cyclin的結合和其中某些氨基酸殘基的磷酸化狀態。當Cyclin濃度升高到閾值時，可作為調節亞基與催化亞基CDK結合形成復合物，驅動細胞周期的運行。當一些增殖信號(生長因子、絲裂原等)與細胞膜上的相應受體結合后，可啟動細胞內的信號轉導，促進CyclinD1的合成，CyclinD1與CDK4相結合后，使抑制蛋白(Rb)磷酸化而喪失抑制轉錄因子E2F的作用，游離的E2F激活DNA合成基因，促使細胞從G0進入G1期[6]。除了促進細胞進入細胞周期進行分裂外，研究還發現，CyclinD1可以結合組蛋白去乙酰基酶 P/CAF，亦可以結合轉錄因子TFⅡD[7]等，通過和這些轉錄因子的結合，起到促進細胞周期運行的作用，而起過度表達則可致細胞增殖失控而發生惡性化。

PCNA也是一種細胞周期相關蛋白，但它不與CDK相結合，而是作為DNA聚合酶的附屬蛋白，促進DNA的延伸，在G1晚期，其表達大幅度增加，S期達到高峰，G2～M期明顯下降，其量的變化與DNA合成一致，檢測其在細胞中的表達，可作為評價細胞增殖狀態的一個指標[8]。

p21kip1能特意抑制CDK蛋白的功能，對細胞有抑制作用，一旦細胞受到毒素或輻射損害，p21kip1可與CyclinD/CDK結合并抑制其活性，減少pRb蛋白磷酸化，引起G1期阻滯促進修復，調控細胞周期確保遺傳物質精確的傳遞給下一代，以消除DNA損傷而引發腫瘤[9]。

實驗結果表明，藏藥濕生扁蕾作用結腸癌SW480細胞24 h后，與對照組比較， CyclinD1、CDK4、PCNA mRNA的表達減少，p21kip1·mRNA的表達增多，并呈現明顯的劑量依賴關系。說明濕生扁蕾引起結腸癌SW480細胞凋亡可能與其抑制CyclinD1、CDK4、PCNA mRNA的表達和促進p21kip1·mRNA的表達有關，而通過濕生扁蕾對SW480細胞周期及增殖的調控可能有助于對結腸癌患者的病情治療。

[1] 李連弟, 趙平, 孔靈芝. 中國部分市、縣惡性腫瘤的發病與死亡(第三卷)[M]. 北京:人民衛生出版社, 2007. 250-251.

[2] 李寶國. 結腸癌診治的回顧與展望. 齊齊哈爾醫學院學報[J], 2010, 31(13):2124-2125.

[3] 景明, 羅永皎, 劉喜平,等. 藏藥濕生扁蕾提取物的止瀉作用及其急性毒性研究[J]. 中成藥, 2011, 33 (6):1049-1050.

[4] 曹長年, 米琴, 趙宙興,等. 藏藥濕生扁蕾有效成分的研究[J]. 青海農林科技, 2004 (3):12.

[5] 王建枝, 殷蓮華主編. 病理學生理學第8版, 北京:人民衛生出版社, 2013. 10:129-133.

[6] Coqueret O. Linking Cyclins to transcription control[J]. Gene, 2002, 299: 35-55.

[7] Adnane J, Shao Z, Robbins PD. Cyclin D1 associates with the TBP associated factor TAF( Ⅱ) 250 to regulate Sp1 mediated transcrip-tion. Oncogene, 1999, 18: 239-247.

[8] 李宏, 廉斌, 王建,等. Topo11、P170、GST-π、PCNA及E-Cadherin在乳腺癌組織中的表達及臨床意義[J]. 寧夏醫學雜志, 2013(1):12-15.

[9] 馬建安, 焦昌安, 陳剛,等. 染色體9p21基因單核苷酸多態性與新疆維吾爾族人群冠心病的關系 [J]. 新疆醫科大學學報, 2012(12):1638-1642.

國家自然科學基金項目(編號81360522)。

王雅莉(1975-)，女，副教授。研究方向：免疫與分子生物學。

景明(1963-)，男，教授，碩士研究生導師。研究方向：中藏藥新制劑開發研究。

R29

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1007-8517(2014)03-0001-02

2013.12.16)