一個新的小麥-中間偃麥草異代換系的分子細(xì)胞學(xué)鑒定

胡 靜，李 欣，閻曉濤，任永康 ，郭慧娟 ，詹海仙 ，喬麟軼 ，暢志堅 ，張曉軍

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032）

中間偃麥草（Thinopyrum intermedium amphiploid，2n＝6x＝42，EEEEXX或 JJsSt）為禾本科小麥亞族（Triticinae）多年生野生草本植物，是普通小麥（Triticum aestivum，2n＝6x＝42，AABBDD） 的近緣物種之一[1-3]，免疫小麥葉銹、條銹、稈銹、白粉等病害[4]，高抗小麥黃矮病、黑穗病、葉枯病和根腐病等，且有較強的耐鹽堿、耐旱和耐低溫性，生長勢強，再生性好，適應(yīng)性廣等特性。目前，其已成為小麥遺傳改良中具有重要利用價值的野生親本之一[4]，國內(nèi)外學(xué)者已將多個偃麥草的有益基因轉(zhuǎn)移到普通小麥中[5-8]。

本試驗以來源于中間偃麥草的八倍體小偃麥TAI7047（2n＝8x＝56）為橋梁親本，從其與普通小麥晉太170雜交、回交的BC1F6選系中選育出一個高抗稈銹病、白粉病的小麥-中間偃麥草異代換系CH08-141。2011—2012年，分別在四川邛崍電子科技大學(xué)試驗農(nóng)場和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽試驗基地溫室進行了稈銹病和白粉病的接種鑒定。為了明確抗病新種質(zhì)CH08-141中所攜帶的抗病基因來源及其所在的染色體位置，進一步利用基因組原位雜交和SSR分子標(biāo)記技術(shù)對其進行了分析鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

八倍體小偃麥TAI7047為暢志堅[9]利用遠(yuǎn)緣雜交方法選育出的高抗小麥稈銹病、白粉病的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體。晉太170為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所選育的優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種[10]。CH08-141為八倍體小偃麥TAI7047與普通小麥晉太170雜交、回交的BC1F6選系中選育出的高抗稈銹病、白粉病的高代品系?？共¤b定所用病理小種稈銹Ug99和白粉菌E09來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保研究所，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保存繁殖。

1.2 方法

1.2.1 抗病性鑒定 為分析CH08-141的抗病特性及其所攜帶的抗病基因來源，于2011—2012年，分別在四川省邛崍市電子科技大學(xué)試驗農(nóng)場對CH08-141及其雜交親本TAI7047、晉太170和TAI7047的親本中間偃麥草、晉春5號接種目前我國流行的稈銹菌小種Ug99，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽試驗基地溫室接種白粉菌小種E09進行抗病鑒定，使用高感品種SY95-71作為感病對照及誘發(fā)材料。接種15～18 d后，當(dāng)感病品種充分發(fā)病時，按 0（免疫）、0；（過敏性壞死）、1（高抗）、2（中抗）、3（中感）和4（高感）的6級分級標(biāo)準(zhǔn)分別調(diào)查、記載其稈銹病和白粉病的侵染型，其中，0～2的侵染型為抗病，3～4的侵染型為感病。

1.2.2 根尖細(xì)胞中期染色體制備 根尖細(xì)胞中期染色體制備、探針標(biāo)記及原位雜交程序參照Han等[11-12]描述的方法進行。

將CH08-141種子放到吸滿水的濾紙上，置于培養(yǎng)皿中，24℃進行發(fā)根；當(dāng)根尖長到1.0～1.5 cm時，剪取根尖端0.5 cm，放入打孔并噴了水的1.5 mL離心管中，室溫下使用N2O處理2 h；然后用90%冰乙酸固定10 min，再用蒸餾水沖洗3次，待無明顯乙酸味時置入70%乙醇中保存?zhèn)溆谩⒗w維素酶與果膠酶按一定比例混合均勻，取1 mL混合酶液放入0.5 mL離心管中，在37℃恒溫保濕箱中預(yù)熱5 min；將用蒸餾水洗凈的根尖放入混合酶液中，保持37℃處理50 min；將多余酶液吸出，用蒸餾水將根尖沖洗3次，然后加入20μL 1×TE溶液，用鑷子將根尖擠碎并混勻；用移液器吸取20μL細(xì)胞懸混液，于載玻片上方10 cm處滴片；晾干后在顯微鏡下觀察染色體的分散效果。

1.2.3 基因組原位雜交（GISH） 基因組DNA的提取采用CTAB法[13]。以Chroma Tide Alexa Fluor 488-5-dUTP1標(biāo)記的中間偃麥草基因組DNA作探針，以中國春基因組DNA作封阻，對CH08-141的根尖細(xì)胞中期染色體進行基因組原位雜交分析。

選取分散均勻、染色體數(shù)目完整的制片放入紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)；每個制片滴加稀釋好的探針（以2×SSC和 1×TE溶液稀釋到 20 ng/μL）6μL；蓋上塑料蓋玻片，放入鐵盤，在100℃沸水中處理5 min，再放入55℃恒溫保濕箱中雜交過夜；雜交好的制片使用2×SSC溶液沖洗2次，晾干后滴1滴DAPI（4，6-diamidino-2-phenylindole），蓋上玻璃蓋玻片；在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 SSR標(biāo)記分析 選取48對平均分布于小麥基因組染色體上的小麥特有SSR引物，覆蓋小麥全部基因組ABD染色體，每條染色體上長、短臂各選取2對引物，以晉太170、中國春、TAI7047、晉春5號、中間偃麥草為對照，對CH08-141進行分子標(biāo)記的染色體定位，從而判定CH08-141中被代換染色體所屬小麥基因組。

2 結(jié)果與分析

2.1 CH08-141抗病性分析

以SY95-71作為感病對照，用稈銹菌小種Ug99和白粉菌小種E09對CH08-141及其親本進行抗病性鑒定。結(jié)果表明，CH08-141對這2個小種均表現(xiàn)高抗（表1）。

表1 CH08-141、八倍體小偃麥TAI7047及其親本對白粉病和稈銹病的抗性表現(xiàn)

通過對其雜交親本TAI7047、晉太 170及TAI7047的親本中間偃麥草和晉春5號抗病鑒定結(jié)果進行分析，結(jié)果（表1）顯示，中間偃麥草對Ug99和E09均表現(xiàn)免疫，其侵染型為0級；CH08-141和TAI7047表現(xiàn)為近免疫，其侵染型為0；級；而CH08-141和TAI7047的小麥親本晉太170和晉春5號均高感稈銹病和白粉病，其侵染型為4級。因此，推測CH08-141對稈銹病和白粉病的抗病基因可能來源于八倍體小偃麥及其野生親本中間偃麥草。

2.2 GISH結(jié)果分析

CH08-141是利用優(yōu)質(zhì)強筋小麥新品種晉太170與來源于中間偃麥草的八倍體小偃麥TAI7047通過回交轉(zhuǎn)育法選育的高抗小麥稈銹病、白粉病的小麥新種質(zhì)，其自交后代表現(xiàn)穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)性狀分離的情況；不同單株種子進行根尖有絲分裂中期檢測結(jié)果顯示，其染色體數(shù)目均為2n＝42，與普通小麥相同。

以Chroma Tide Alexa Fluor 488-5-dUTP1標(biāo)記的中間偃麥草DNA作探針、中國春基因組DNA作封阻的原位雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每個細(xì)胞分裂相中均有1對染色體被激發(fā)出綠色熒光（圖1），表明CH08-141中有1對染色體被中間偃麥草染色體所代換。

2.3 SSR標(biāo)記結(jié)果分析

使用平均分布于小麥基因組ABD染色體上的48對SSR引物對CH08-141及其親本TAI7047和晉太170以及TAI7047的親本中間偃麥草和晉春5號進行小麥特異標(biāo)記鑒定，結(jié)果顯示，位于小麥染色體6BS上的GWM508和位于小麥染色體6BL上的GWM219，WMC494表現(xiàn)出明顯差異，對照品種中國春、小麥親本晉太170、晉春5號及TAI7047都擴增出其特有帶型，而CH08-141、中間偃麥草則表現(xiàn)為帶型缺失（圖2）；位于小麥其他染色體上的SSR引物擴增結(jié)果均表現(xiàn)為：CH08-141、對照品種中國春、小麥親本晉太170、晉春5號及TAI7047都擴增出其特有帶型，而中間偃麥草則表現(xiàn)為帶型缺失。因此，初步判定CH08-141中被代換的染色體屬于小麥B基因組第6同源群，即6B染色體。更加準(zhǔn)確的結(jié)果還有待于進一步深入分析。

3 討論

八倍體小偃麥?zhǔn)侨藗冊诶觅塞湶菖c普通小麥進行遠(yuǎn)緣雜交過程中人工選育的一種植物新物種，除含有普通小麥完整的42條染色體外，還包含來源于偃麥草的14條染色體，保留了偃麥草的許多優(yōu)良性狀，因其與普通小麥染色體組成相近，可以有效克服遠(yuǎn)緣雜交過程中極易出現(xiàn)的染色體不親和現(xiàn)象，因此，成為普通小麥利用外源基因進行遺傳改良的重要途徑之一。TAI7047為暢志堅[9]選育的八倍體小偃麥新類型，具有抗條銹、葉銹、稈銹病及優(yōu)質(zhì)、多年生等優(yōu)良特性，是偃麥草有用基因向小麥轉(zhuǎn)移的重要橋梁材料。

CH08-141高抗稈銹病、白粉病，兼具雙親的優(yōu)良農(nóng)藝性狀，是一個新型的小麥種質(zhì)系。由于其小麥親本晉太170高感稈銹病和白粉病，而TAI7047及其野生親本中間偃麥草對稈銹病和白粉病表現(xiàn)免疫，因此，推測CH08-141對稈銹病和白粉病的抗病基因可能來自TAI7047，抗病基因也可能位于它們含有的偃麥草染色體上[14]。中間偃麥草的J或Js組染色體攜帶有抗白粉病及稈銹病基因[15]，它與普通小麥雜交選育的后代如果含有J或Js組染色體，那么這個材料也就攜帶有此抗病基因。根據(jù)暢志堅[9]對八倍體小偃麥TAI7047的GISH分析，其外源基因組由1對S組染色體、1對S組與J組的中間易位染色體和6對J組染色體組成，未發(fā)現(xiàn)有Js組染色體存在。因此，推測CH08-141很可能是由中間偃麥草的J組染色體代換了小麥的6B染色體所形成的異代換系，其所含有的外源染色體對被代換的小麥染色體在功能上具有良好的補償作用[16]，不僅能夠保持小麥高產(chǎn)、高效的特點，還具有偃麥草的某些優(yōu)良性狀，在小麥抗病育種及遺傳改良中具有重要的意義。

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