燕麥microRNAs及其靶基因的生物信息學預測

郭紅媛，賈舉慶，段 娜，張怡晴，舒國平，陳瀟灑

（山西農業大學農學院，山西太谷030801）

microRNAs（miRNA）是在真核生物中發現的一類內源性且具有調控功能的非編碼單鏈RNA，大小約為22個核苷酸。其主要參與發育、病毒防御、信號轉導等多種調控[1-3]。成熟miRNA識別靶基因位點后，可與靶基因位點緊密結合，破壞或阻遏蛋白質翻譯機制。由于序列微小，因此，一般極難檢測。現在已發現大量的miRNAs，新的miRNAs也正陸續被發現。miRNA通常可以控制多個靶位點，它們可以與多達1 000種甚至更多不同的靶位點結合，有時基因也可能受到多個miRNA調控，因此，難以了解其復雜的相互作用。

目前，研究miRNA表達量和表達位點可采用分子生物學和生物信息學等方法。其中，分子生物學法可以特異性地鑒定miRNAs，但依賴于極強的技術能力，且耗時耗力，成本高[4]。隨著新一代測序技術的發展，small RNA測序技術為發現miRNAs提供了強有力的手段。此外，根據miRNAs在植物物種中的高度保守性，利用比較基因組學和生物信息學方法可以從大量已測序的EST和GSS等數據庫中挖掘、鑒定miRNAs，了解miRNA群或其結構信息并獲取更多的細胞功能分析。

目前，利用生物信息學方法已在玉米、小麥、高粱等植物中有效地預測到大量的miRNA[5-8]。燕麥是一種糧、經、飼、藥兼用的世界分布型植物，因其營養價值高而且具有抗病、耐瘠、抗旱等優良性狀而引起了眾多研究者的關注[9-11]，公共數據庫中也積累了大量的EST和GSS序列，這為研究燕麥提供了很好的可利用資源。目前，對燕麥miRNA的鑒定以及對靶基因調控方面的研究尚未見報道。

本研究根據miRNA序列的保守性，用大麥、小麥、二穗短柄草等植物miRNAs序列在燕麥EST數據庫和GSS數據庫中進行檢索和篩選，預測得到燕麥miRNA及其靶基因，補充了燕麥miRNA數據，并為燕麥miRNA對抗旱性調控等研究方面奠定了一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 序列來源

根據序列在進化方面的保守性，采用同源性搜索方法，從miRNA數據庫miRBase（http://www.mirbase.org/index.shtml）下載已登記的1 910條miRNA序列。在美國國家生物技術信息中心（NCBI）收錄的燕麥EST數據庫和概覽序列（GSS）數據庫中，將1 910條miRNA序列去重復后用來檢索潛在的燕麥miRNA序列。

1.2 序列檢索方法

從miRNA數據庫中下載已有植物miRNA序列，用多序列比對軟件ClustalW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）比對后去除重復序列；用這些序列進行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線比對，檢索NCBI中的燕麥EST和GSS數據庫，將少于4個堿基錯配的同源序列作為重復序列去除；再與NCBI數據庫中進行BLASTX比對，去除燕麥蛋白質編碼序列后，將剩余序列作為燕麥候選miRNA序列。

1.3 miRNA二級結構及靶基因的預測

將所得序列用Mfold 3.2軟件（http://mfold.rit.albany.edu/?q＝mfold/RNA-Folding-Form）預測其二級結構，根據對miRNA的篩選標準[12-13]進行預測、鑒定。用psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）對符合miRNA二級結構標準的序列進行靶基因預測。

2 結果與分析

2.1 燕麥miRNAs的預測

從 miRBase下載山羊草（2）、二穗短柄草（464）、油棕（6）、高羊茅（15）、大麥（69）、水稻（713）、高粱（241）、甘蔗（36）、小麥（43）和玉米（321）已登記的miRNA序列，截至2013年10月共1 910條。對其進行多序列比對后，將重復序列只保留1條。用留下來的序列檢索NCBI中的燕麥EST和GSS數據庫，檢索到的序列經多序列比對，重復序列保留1條。然后，將留下來的序列在燕麥的蛋白質數據庫中進行BLASTX比對（以去除其中編碼序列），結果共獲得143條非編碼的候選燕麥miRNA序列，對143條pre-miRNA的統計分析得到的參數（前體序列長度L＞60 nt；GC含量為30%＜CG＜71%；二級結構生成自由能△G＜-41.18 kJ/mol）進行進一步篩選，若符合所有條件的片段則作為候選，不符合這些條件的片段則棄之。之后，對候選序列用Mfold

3.2 進行二級結構預測并分析。

根據預測miRNA二級結構的標準，miRNA前體結構中具有莖環結構，且成熟的miRNA盡量位于莖環結構的臂上；miRNA與互補鏈間錯配應少于5個堿基；miRNA互補鏈上不能有大的突起或缺口；以最小折疊自由能系數（MFEI）大于8.5來判斷所預測的序列是否為符合二級結構的miRNA序列（圖1）。

經分析、篩選，共有46條序列符合miRNA鑒定標準，表1列出了其中的10條。

2.2 燕麥miRNA靶基因的預測

經psRNATarget在線預測所得的46條符合鑒定標準的燕麥miRNA序列的靶基因，預測時選擇期望值為3.0，允許不配對的最大能量（UPE）小于25.0，其余參數為默認值。結果共找到61個靶基因，部分序列的功能信息列于表2。

表1 預測到的燕麥miRNAs

表2 預測到的燕麥miRNA靶基因

3 討論

本研究預測的燕麥miRNAs序列，首先其前體序列必須具有重要特征——發卡結構，而且預測的成熟miRNA序列要盡量位于其前體序列二級結構的“臂”上，避免處于“環”結構中；如不能避免，其與“環”結構最多有4 nt配對。為與其他類型的RNAs進行區分，又采用了2個鑒定miRNA的重要參數，即最小折疊自由能（MFE）和最小折疊自由能系數（MFEI），研究發現，MFE與前體序列的長度和GC含量有關，燕麥miRNA前體的MFEI平均值為1.06，高于 mRNA（0.62～0.66），rRNA（0.59）和 tRNA（0.64）[14]，也高于前人的研究結論 0.85，結果證實，MFEI為預測miRNA的重要且可靠參數。

在預測到的靶基因中，絕大多數是編碼與生長發育有關的蛋白質，參與新陳代謝，編碼轉錄因子調控生長、發育以及其他生理代謝過程，如膜蛋白相關的物質運輸、細胞信號轉導等。這些靶基因分別屬于不同的基因家族，部分靶基因編碼的蛋白功能未知。本研究預測的miRNAs前體序列中有的具有多個成熟的miRNA序列，前體序列長度為107～315 nt。預測的成熟miRNAs的位置有的位于3'端，有的位于5'端。所預測的所有miRNA前體序列在長度和二級結構方面雖各不相同，但都分別可折疊成標準的miRNA二級結構。在預測的燕麥miRNA序列中大多是編碼與生長發育相關的蛋白質，可能參與燕麥生長中的新陳代謝活動，有一些是與信號傳導相關的，還有一些可能是編碼轉錄因子的。但由于目前燕麥基因組信息在網上公布信息的不完全，本研究對部分預測的miRNA序列仍未能預測到其功能。目前，有許多軟件可對RNA功能進行預測，如：TargetScan（http://www.targetscan.org/），PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/），MiRscan（http://genes.mit.edu/mirscan/）等。想要得到準確的預測結果，可以用多種軟件反復預測、比較，但預測結果最終需經實驗進一步驗證。

miRNAs作為一種非編碼的基因表達調控因子，雖已有在小麥、水稻、玉米、棉花、花生、煙草等[15-17]方面的研究，但目前對燕麥miRNAs生物學功能及調控機理的研究還不多。本研究預測了燕麥miRNAs序列及其靶基因，為進一步研究燕麥miRNAs的功能奠定了基礎（可為開展具體的實驗驗證提供依據，從而對燕麥miRNAs生物學功能注釋縮小范圍）。相信隨著生物信息學的發展，會有更多、更全面的基因組序列公布于網上，會發現更多的燕麥miRNAs。

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