突破光學顯微鏡的極限

本刊記者

瑞典皇家科學院宣布，將2014年諾貝爾化學獎授予美國科學家埃里克·貝齊格、威廉·莫納和德國科學家斯特凡·黑爾，以表彰他們為發展超高分辨率熒光顯微鏡做出的貢獻。長期以來，光學顯微鏡的分辨率都被認為是有極限的，即不可能超過光波波長的一半，這被稱為“阿貝極限”。然而，獲獎的3位科學家打破了這一極限，使光學顯微鏡步入了納米時代。

為什么說光學顯微鏡是有極限的？

顯微鏡的發明打開了通往微觀世界的大門。顯微鏡的最早起源可追溯至1590年的荷蘭，當一位眼鏡商人的兒子在玩弄鏡片時，偶然發現兩塊透鏡在一定距離觀察物體時，物像顯得格外大。把兩塊透鏡固定在直徑不同的圓筒上，并使小圓筒能在大圓筒內自由滑動，這便成了今天顯微鏡的原始雛形。1665年，英國人羅伯特·胡克用他制作的顯微鏡觀察樹皮切片，看到一些密集排列的小孔，他稱之為“cell”，現在我們沿用了這個名稱，中文翻譯為“細胞”。作為細胞的命名人，胡克當時所看到的其實并不是真正意義上的細胞。與胡克同時代的荷蘭人列文虎克憑借他精心磨制的鏡片制成了更精密的顯微鏡，第一次發現了血液里的細胞以及土壤中各種各樣的微生物。

前面提到的顯微鏡是光學顯微鏡，也就是利用可見光，將微小物體形成放大影像的光學儀器。經過不斷的改進，光學顯微鏡已經可以達到放大1600倍的效果了，這意味著科學家們可以辨別完整細胞，以及其中比較大的細胞器（如葉綠體、線粒體）的輪廓結構，但卻無法分辨一個正常大小的病毒或者單個蛋白分子。那么，光學顯微鏡的放大效果有沒有可能繼續甚至是無限提高呢？

很遺憾，答案是否定的。光學顯微鏡的分辨率是有一個極限的，也就是說，用光學顯微鏡永遠無法看到小于光波長一半的物體。這個極限被稱為“阿貝極限”，它是德國物理學家、光學家恩斯特·阿貝于19世紀70年代提出來的。阿貝發現，可見光由于其波動特性，會發生衍射，因而光束不能聚焦到無限小。可見光波長范圍為400納米～780納米，以可見光中波長最短的藍紫光來說，其波長在400納米左右，因此，如果兩點之間的距離小于200納米，我們將無法分辨出這兩個點（如圖1）。

一個多世紀以來，200納米的“阿貝極限”一直被認為是光學顯微鏡理論上的分辨率極限，小于這個尺寸的物體必須借助電子顯微鏡才能觀察。

電子顯微鏡是20世紀二三十年代發展起來的成像技術，它利用高能短波長電子束代替可見光作為光源，通過電子束與物體衍射作用工作，放大倍數可高達數十萬倍。既然有了分辨率極高的電子顯微鏡，科學家是不是就沒有必要再糾結于光學顯微鏡的分辨率極限了呢？并不是這樣的。因為電子顯微鏡需要在真空條件下工作，還要經過復雜的標本處理過程，所以很難觀察活的樣本，而且電子束的照射也會使生物樣品受到輻照損傷。對于生物學家而言，還有什么比讓細胞活生生地出現在眼前更令人激動的呢？

突破“阿貝極限”的兩種方案

熒光顯微鏡也是一種光學顯微鏡，故同樣跳不出“阿貝極限”，只不過利用熒光分子為細小的物體“標記”，科學家可以更有針對性地觀察和追蹤他們感興趣的內容。在突破“阿貝極限”的方案中，有兩種各自獨立發展出來的技術方法。

如圖1所示，光源一次把處于這個半徑里面的粒子照亮，看起來模糊一片，根本無法分辨每一個粒子。斯特凡·黑爾想到一個絕妙的點子：既然一次都亮起來看不清，那我就分兩步。簡單來說，就是用兩束激光，一束激光激發熒光分子發光（圖2左），這個光斑已達分辨率的極限，不能再小了；另一束激光則比較特殊（圖2中），就把它想象成一個“面包圈”吧！當兩束光聚焦到同一個點上，第二束光就把第一束光給滅了，只有中間那個點沒有滅掉（圖2右），這更小的點便突破了分辨率的極限。這就是斯特凡·黑爾開發出的STED顯微鏡的原理，STED全名是Stimulated Emission Depletion，意為受激發射損耗。斯特凡·黑爾正是利用這個原理，通過巧妙的設計，將STED顯微鏡的光斑尺寸變得非常小，然后用它一小點一小點地去掃描整個觀察區域，就得到了分辨率高于傳統光學顯微鏡的圖像。

貝齊格和莫納則通過各自的獨立研究，為另一種顯微鏡技術——單分子熒光顯微成像技術的發展奠定了基礎。與STED不同，這種方法不是在顯微鏡的光斑尺寸上做文章，也不必先“點亮”再“熄滅”，而通過類似圖像疊加的原理，巧妙地擺脫了“阿貝極限”的束縛。如圖3示意，不是相鄰兩點之間的距離小于200納米就無法分辨嗎？那么，我們就依靠“開關”單個熒光分子，分別讓不相鄰且間距大于200納米的兩點發光，這樣不就可以把它們區分開來嗎？然后，再把每一次得到的圖像疊加，用一定的數學方法加以處理，同樣能得到分辨率高于傳統光學顯微鏡的圖像。

光學顯微鏡步入納米時代

雖然這些新的光學顯微技術可以使我們看到更小的物體，但并不意味著“阿貝極限”被推翻了，科學家們只是另辟蹊徑地繞過了這個障礙。一旦掙脫了極限的束縛，光學顯微成像技術便向納米尺度大幅邁進，并將為疾病研究和藥物研發帶來革命性變化。

以STED技術為例，它在理論上已經可以達到40納米～50納米的分辨率。從此以后，科學家們就能在顯微鏡下“實時”觀察活體生物細胞內單個分子的運動情況了。他們可以觀測分子如何在腦神經細胞之間建立突觸，可以研究與帕金森氏癥、阿爾茨海默氏癥和亨廷頓氏癥有關的蛋白質變化情況，還可以追蹤胚胎內部細胞的分裂過程。這也正是3位獲獎者以及其他許多科學家們目前所從事的工作。

3位獲獎者的簡介如下：

斯特凡·黑爾：1962年生于羅馬尼亞，目前任職于德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所和德國癌癥研究所。

埃里克·貝齊格：1960年生于美國，目前任職于美國霍華德·休斯醫學研究所。

威廉·莫納：1953年生于美國，目前任職于美國斯坦福大學。

【責任編輯】龐 云