甘肅甘南野生羊肚菌rDNA的ITS序列分析

王 龍，秦 鵬，王生榮，趙玉卉

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省科學(xué)院 生物研究所， 甘肅 蘭州 730000)

羊肚菌Morchellavspp.隸屬于子囊菌亞門Ascomycotina、盤菌綱Discomycetes、盤菌目Pezizales、羊肚菌科Morchellaceae，是世界公認(rèn)的一類珍稀食(藥)用真菌。現(xiàn)有資料表明，各種羊肚菌相互間的宏觀特征有著明顯的差距，目前，不同學(xué)者對(duì)羊肚菌種的劃分從3個(gè)種到32個(gè)種不等[1]。在我國(guó)西南各省、華東地區(qū)以及西北省份均已見到有關(guān)羊肚菌的種類分布、生態(tài)環(huán)境、資源調(diào)查與研究利用等方面的詳實(shí)報(bào)道[2-6]。甘肅省甘南藏族自治區(qū)位于甘、青、川的過渡地帶，地理位置N 33°20′～35°40′，E 100°52′～104°45′，海拔3 000～4 000 m，地勢(shì)高崇，屬高寒氣候區(qū)[7]。該地區(qū)植被覆蓋率高，生物群落穩(wěn)定，其獨(dú)特的氣候特點(diǎn)造就了豐富的生物資源，也為羊肚菌的發(fā)生提供了優(yōu)越的多樣性生態(tài)條件。應(yīng)用rDNA的ITS序列分析方法對(duì)在甘南地區(qū)采集、收集到的野生羊肚菌進(jìn)行了分類鑒定，為深入研究該地區(qū)羊肚菌種類分化的變異規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

2011～2013年，以甘肅省甘南境內(nèi)的森林山地、高原濕地和高寒草甸3種不同生態(tài)類型為重點(diǎn)進(jìn)行當(dāng)?shù)匾吧蚨蔷婢Y源的采集與收集工作，先后共采集62株形態(tài)完好的野生羊肚菌子實(shí)體標(biāo)本。參照卯曉嵐主編《中國(guó)蕈菌》(2009年第1版)，根據(jù)收集到的羊肚菌子囊果的形狀、顏色、大小及脈絡(luò)特征等，同時(shí)參照網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)“Index Fungorum”中羅列的世界范圍內(nèi)羊肚菌的名稱(包括種、亞種、變種及變型)，初步將其分類編號(hào)GN-M1、GN-M2、GN-M3、GN-M4、GN-M5、GN-M6和GN-M7。7個(gè)供試菌株子實(shí)體形態(tài)特征見圖1。

1.2 基因組DNA的提取和ITS序列的擴(kuò)增

取羊肚菌子實(shí)體的菌蓋部分，用新型植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取樣品基因組DNA，并保存于4 ℃冰箱。采用White設(shè)計(jì)的ITS擴(kuò)增通用引物ITS1和ITS4對(duì)供試材料的rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。

ITS引物：上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′

下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′

(引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。

圖1供試羊肚菌子實(shí)體形態(tài)

Fig.1ThemorphologyofMorchellaspp.

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50μL，含:10×PCR buffer 5.0 μL；dNTPs 1.0 μL；模板DNA 1.0 μL；ITS1 1.0 μL；ITS2 1.0 μL；Taq聚合酶1.0 μL；雙蒸水40.0 μL[9]。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)平10 min，終止溫度為4 ℃。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄電泳譜帶。

1.3 ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析和系統(tǒng)樹的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，使用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供的UNIQ-10柱式 DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收和純化，并將樣品送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。用DNAman對(duì)序列進(jìn)行拼接，并對(duì)兩端進(jìn)行修剪。將序列在GenBank上進(jìn)行BLAST分析，利用ClustalX 1.81進(jìn)行同源性比較，MEGA 6.0繪制分子系統(tǒng)樹[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果及BLAST比對(duì)分析

PCR擴(kuò)增出的目的片段條帶單一清晰(圖2)，GN-M1，GN-M2，GN-M3，GN-M4，GN-M5大小在1 000 bp～2 000 bp。序列經(jīng)DNAman拼接后，大小均為1 200 bp，GN-M6和GN-M7的ITS序列在760 bp。將各供試樣品的ITS序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，GN-M1、GN-M2、GN-M3與粗柄羊肚菌(GQ228465、AJ623265、GQ228446)序列的相似度達(dá)98%～99%；GN-M4、GN-M5與羊肚菌 (AM397272)序列的相似度達(dá)95%；GN-M6與黑脈羊肚菌(AJ544203)序列的相似度達(dá)99%；GN-M7與高羊肚菌(EF017946)序列的相似度達(dá)98%，且GN-M1、GN-M2、GN-M3和GN-M4、GN-M5的G+C含量>55%，GN-M6和GN-M7的G+C含量<55%(表1)。即BLAST比對(duì)的結(jié)果表明，7個(gè)供試羊肚菌子實(shí)體代表羊肚菌屬中的4個(gè)種，分別為粗柄羊肚菌M.crassipes、羊肚菌M.esculenta、黑脈羊肚菌M.angusticeps和高羊肚菌M.elata。

圖2 PCR擴(kuò)增的ITS片段電泳檢測(cè)圖

注：圖中1 GN-M1，2 GN-M2，3 GN-M3，4 GN-M4，5 GN-M5，6 GN-M6，7 GN-M7

2.2 基于ITS序列的系統(tǒng)樹

把7個(gè)樣品的ITS序列與GenBank中的尖頂羊肚菌M.conica(AM269501)、小海綿羊肚菌M.spongiola(DQ228476)、半開羊肚菌M.semilibera(AF008233)、高羊肚菌M.elata(EF017946)和紅褐羊肚菌M.rufobrunnea(DQ355921)的 ITS序列進(jìn)行比對(duì)，并用MP法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。從分子系統(tǒng)樹可以看出(圖3)，GN-M1、GN-M2、GN-M3和GN-M4和GN-M5與小海綿羊肚菌M.spongiola聚為第1類群，屬于形態(tài)學(xué)分類中的黃羊肚菌類群(yellow morel)；GN-M6、GN-M7與高羊肚菌M.elata和尖頂羊肚菌M.conica聚為第2類群，屬于形態(tài)學(xué)分類中的黑羊肚菌類群(black morel)，紅褐羊肚菌和半開羊肚菌各自單獨(dú)聚為一類。聚類結(jié)果表明，試驗(yàn)樣品與這幾種羊肚菌有一定的遺傳距離，但樣品彼此之間的遺傳關(guān)系很近，粗柄羊肚菌和羊肚菌屬于黃羊肚菌類群(yellow morel)，而黑脈羊肚菌和高羊肚菌屬于黑羊肚菌類群(black morel)。

表1 羊肚菌ITS測(cè)序結(jié)果

圖3 基于ITS序列的分子系統(tǒng)樹(MP法，Bootstrap驗(yàn)證，重復(fù)1 000次)

3 討論

rDNA的ITS區(qū)同時(shí)具有多變區(qū)和保守區(qū)，5.8S、18S和28S的序列在進(jìn)化中趨于保守，種間變化小，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，最終不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度快，種間差異大，且變異速度存在著較大的差異，適合種及種以下水平的分類研究[11]。以ITS區(qū)作為信號(hào)分子對(duì)甘肅甘南藏族自治州境內(nèi)的野生羊肚菌進(jìn)行了分子鑒定，發(fā)現(xiàn)7株供試羊肚菌菌株代表4個(gè)種，分別為粗柄羊肚菌、羊肚菌、黑脈羊肚菌和高羊肚菌，并歸為黃羊肚菌類群(yellow morel)和黑羊肚菌類群(black morel)兩大類。從分子系統(tǒng)樹看來，供試羊肚菌之間ITS序列變異較大，可能是因?yàn)樯L(zhǎng)地的氣候、海拔、植被等環(huán)境因素的不同導(dǎo)致羊肚菌的子實(shí)體有形態(tài)上的差別，對(duì)羊肚菌的系統(tǒng)進(jìn)化產(chǎn)生了不同的影響，此種種內(nèi)差異還有待收集更多的資料進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1] 蘭進(jìn),曹文芩,徐鏡堂.中國(guó)羊肚菌屬真菌資源[J].資源科學(xué),1999，21(02):58-63.

[2] 沙業(yè)雄.羊肚菌的研究進(jìn)展[J].食用菌,1990，12(02):3-4.

[3] 龍正海,秦京.羊肚菌的生態(tài)及分類學(xué)研究進(jìn)展[J].貴州科學(xué),1993，11(3):75-76+74.

[4] 任桂梅,張少剛.羊肚菌的研究進(jìn)展[J].延安大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1999，19(1):57-64.

[5] 林汝楷.羊肚菌的研究進(jìn)展[C]//全國(guó)第6屆食用菌學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.上海:上海農(nóng)科院科技信息所,上海農(nóng)科院食用菌研究所,2001：80-81.

[6] 謝占玲,謝占青.羊肚菌研究綜述[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)：2007，25(2):36-40.

[7] 段麗潔,張鐳,李英華,等.環(huán)境變化與尕海-則岔自然保護(hù)區(qū)維護(hù)[J].干旱氣象,2005，23(3):53-57.

[8] White T J,Bruns T,Lee S,etal.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M].New York:Academic Press,1990：315-322．

[9] 胡克興.羊肚菌屬及其相關(guān)屬分子系統(tǒng)學(xué)研究[D].北京:首都師范大學(xué)，2005.

[10] Chenna R,Sugawara H,Koike T,etal.Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs[J].Nucleic Acids Research.2003，31(13):3497-3500.

[11] 陳鳳毛.真菌ITS 區(qū)序列結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用[J].林業(yè)科技開發(fā),2007，21(2):5-7.