七葉皂苷鈉誘導人單核白血病SHI-1細胞凋亡的研究

王少娟 林筱潔 尹利明 高瑞蘭

1浙江中醫藥大學 杭州 310053 2浙江中醫藥大學附屬第一醫院血液病研究所

七葉皂苷鈉誘導人單核白血病SHI-1細胞凋亡的研究

王少娟1林筱潔2尹利明2高瑞蘭2

1浙江中醫藥大學 杭州 310053 2浙江中醫藥大學附屬第一醫院血液病研究所

目的研究七葉皂苷鈉對人急性單核白血病細胞株SHI-1細胞的抑制增殖及誘導凋亡的作用。方法SHI-1細胞經不同濃度的七葉皂苷鈉處理后，MTT法分析七葉皂苷鈉對SHI-1細胞增殖的抑制作用，AnnexinⅤ/PI染色流式細胞術（FCM）檢測細胞凋亡率，DNA凝膠電泳觀察凋亡特異性DNA降解梯形條帶，半定量PCR檢測凋亡特異性酶Caspase-3 mRNA表達水平。結果MTT法顯示七葉皂苷鈉能顯著抑制SHI-1細胞的增殖，呈時間和劑量依賴性（P<0.05）。經不同濃度的七葉皂苷鈉處理24h，AnnexinⅤ/PI染色顯示AnnexinⅤ陽性的凋亡細胞率明顯上升，DNA瓊脂糖凝膠電泳分析出現凋亡特異性的DNA降解梯形條帶，半定量PCR顯示Caspase-3 mRNA表達水平隨藥物濃度增加而升高（P<0.05）。結論七葉皂苷鈉對SHI-1細胞具有抑制增殖和誘導凋亡的作用，可能是其抗白血病作用途徑之一。

SHI-1細胞；凋亡；七葉皂苷鈉

七葉皂苷鈉（Sodium aescinate）是從七葉樹科中國天師栗Aesculus wilsonii Rehd、歐洲七葉樹Aesculus hippocastanum L、日本七葉樹Aesculus turbinate Blume和浙江七葉樹Aesculus chinensis Bunge var.chekiangensis，Hu et Fang干燥成熟果實娑羅子中提取的天然三糖苷類化合物的鈉鹽，具有具有消炎、抗滲出、恢復毛細血管通透性、提高靜脈張力、改善血液循環、促進腦功能恢復及神經保護等作用[1]。七葉皂苷鈉在臨床上應用廣泛，國內主要用于治療腦水腫、腦梗死、顱腦外傷及肢體腫脹等疾病[2]。曾報到七葉皂苷鈉對白血病細胞株Jurkat、HL-60細胞有抑制增殖的作用，而且其作用呈時間和劑量依賴性[3-4]，但對侵襲性強的人單核白血病SHI-1細胞株的研究尚未報道。本研究觀察七葉皂苷鈉抑制SHI-1細胞增殖和誘導凋亡的作用，為其抗白血病作用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 SHI-1細胞 由江蘇省血液病研究所惠贈。將人急性單核細胞白血病細胞株SHI-1細胞懸浮生長于10%小牛血清的IMDM培養液中，含青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100U/mL），置 37℃、5%CO2孵箱中培養。每2～3天換液1次，以維持良好的生長狀態。

1.2 七葉皂苷鈉注射液 由綠葉制藥股份公司生產，從中藥天師栗的成熟果子中提取，批號：1208154。

1.3 儀 器 細胞培養箱（美國Forma Scientific公司）、移液器（法國Gilson公司）、普通光學顯微鏡（日本Olympus公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、酶標儀（美國Bio-Tek儀器公司）、FACSCalibur流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

2 實驗方法

2.1 噻唑藍（MTT）比色實驗 取對數生長期良好的SHI-1細胞，按5×104/孔的密度接種于96孔培養板中，分別用 0、10、20、30、40、50mg/L 濃度的七葉皂苷鈉處理SHI-1細胞24、48h，每組設3個復孔，每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，培養4h后，棄去培養基，每孔加 DMSO 150μL，振蕩 10min，于酶標儀上490nm波長，測定各孔吸光度OD值，0mg/L濃度為對照組，下同。

2.2 AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡 SHI-1細胞經 0、10、20、30、40mg/L 濃度的七葉皂苷鈉處理24h，收獲細胞，冷PBS洗2次，加500μL結合緩沖液，混勻后加入5μL Annexin V-FITC和5μL PIFITC工作液，避光染色10min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.3 DNA ladder法檢測細胞凋亡 SHI-1細胞經0、10、20、30、40、50mg/L 濃 度 的 七 葉 皂 苷 鈉 處 理24h，收獲細胞，經冷PBS洗滌后，加入細胞裂解液50μL（1mmol/L EDTA、10mmol/L Tris-HCl、1%NP-40，PH 7.5），1600g/min 離心，取上清，加入 RNase A（終濃度 100μg/mL）和 10%SDS（終濃度 1%SDS），56℃水浴2h。加入10mg/mL的蛋白酶K（終濃度250μg/mL），37℃水浴2h。然后采用1.2%瓊脂糖凝膠、電壓30V電泳5h。

2.4 半定量RT-PCR檢測Caspase-3mRNA表達SHI-1 細胞經 0、10、20、30、40、50mg/L 濃度的七葉皂苷鈉處理24h，收獲細胞，經冷PBS洗滌后，按Trizol試劑說明書提取總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA濃度和純度，測A260/A280在1.8～2.0。RT-PCR反應：cDNA的合成：根據反轉錄試劑盒說明書操作。PCR擴增混勻后置PCR儀上擴增，擴增條件：94℃變性 5min，隨后 94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸1min，30個循環，最后72℃延伸7min退出。Caspase-3 上游引物 5’-GAACTGGACTGTGGCATTGAG-3’，下游引物 5’-CAAAGCGACTGGATGAACCA-3’，產物為161bp，以β-actin為內參。1.5%瓊脂糖電泳，拍照。

3 實驗結果

3.1 七葉皂苷鈉對SHI-1細胞抑制增殖的作用 經不同濃度七葉皂苷鈉處理SHI-1細胞24、48h后，細胞存活率呈時間和濃度依賴關系，見表1。

表1 不同濃度七葉皂苷鈉在不同時間點對SHI-1細胞增殖的影響（±s）

表1 不同濃度七葉皂苷鈉在不同時間點對SHI-1細胞增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05

組別對照組七葉皂苷鈉組n/孔3 3 3 3 3 3濃度（mg/L）0 10 20 30 40 50 24h（A=490）1.06±0.02 0.96±0.03 0.90±0.01*0.68±0.00*0.48±0.02*0.30±0.01*48h（A=490）1.43±0.03 1.32±0.07 1.19±0.02*0.86±0.01*0.52±0.05*0.14±0.02*

3.2 七葉皂苷鈉對SHI-1細胞凋亡的影響

3.2.1 AnnexinⅤ/PI雙染法檢測 10、20、30、40mg/L七葉皂苷處理SHI-1細胞20h后，Annexin-V細胞陽性表達率均高于對照組（P<0.05），且40mg/L濃度，細胞數量明顯減少，見表2。

表2 不同濃度七葉皂苷鈉對SHI-1細胞凋亡的影響（±s） %

表2 不同濃度七葉皂苷鈉對SHI-1細胞凋亡的影響（±s） %

注：與對照組比較，*P<0.05

組別對照組七葉皂苷鈉鈉組n/孔3 3 3 3 3濃度（mg/L）0 10 20 30 40早期凋亡率3.43±0.58 6.76±0.41*8.43±1.25*11.96±1.18*16.63±0.20*晚期凋亡率2.23±1.62 3.33±0.51*5.63±0.05*6.03±0.35*10.46±0.50*

3.2.2 DNA ladder法檢測 七葉皂苷處理SHI-1細胞24h后，30、40mg/L處理的SH-1細胞中出現明顯的DNA梯形條帶，提示七葉皂苷可使細胞內源性核酸內切酶活性增高，將核小體之間的DNA切割成180～200bp的多聚體，見圖1（封二）。

3.2.3 Caspase-3 mRNA表達 用半定量RT-PCR方法檢測caspase-3 mRNA含量，以β-actin作為內參，見圖 2（封二）。

4 討論

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是細胞在各種死亡信號刺激后發生的一系列瀑布式激活的主動性死亡過程，它與腫瘤的發生、發展有著密切的關系[5]。近年來，誘導白血病細胞凋亡已經成為治療白血病研究的新方向。

本實驗發現七葉皂苷鈉具有抑制SHI-1細胞增殖及誘導凋亡的作用，抑制率呈時間和劑量依賴性。細胞凋亡過程中，細胞膜的不對稱性消失，磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞內轉移到細胞外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外，與鈣離子依賴性的磷脂結合蛋白Annexin V結合，故Annexin V可檢測早期凋亡細胞。碘化丙叮（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但能穿過凋亡晚期和死細胞胞膜，使之著色，故Annexin V與PI匹配使用可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來[6]。研究顯示，40mg/L組早期凋亡率最高，而濃度到50mg/L組細胞數量明顯減少，表明較低劑量的七葉皂苷能誘導SHI-1細胞凋亡，并與藥物呈時間和劑量依賴關系，而較高劑量則具有殺傷白細胞的作用。細胞凋亡的一個典型特征是染色體DNA在核小體之間被切斷，產生的DNA長度為180～200bp的整倍數，電泳呈梯形條帶[7]。本實驗在30、40mg/L組顯示DNA降解梯形條帶。

細胞凋亡受多種基因調控，并與Caspase-3家族密切相關。Caspase為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的簡稱，根據Caspase在凋亡中的作用分為兩大類：啟動性Caspase和效應性Caspase，Caspase-3即為效應性Caspase，它除了參與細胞因子成熟，細胞生長和分化之外，還與細胞凋亡密切聯系。Caspase級聯反應在細胞凋亡通路中處于重要地位，尤其是Caspase-3是其中的中心環節。Caspase-3是目前發現Caspase成員中引起細胞凋亡的關鍵性激酶，也是細胞凋亡的主要參與成分[8]。七葉皂苷鈉通過何種途徑誘導人單核SHI-1細胞凋亡，尚需進一步實驗研究。

［1］Sirtori CR.Aescin：pharmacology，pharmacokinetics and thera-peutic profile［J］.Pharmacol Res，2001，44（3）：183-93.

［2］侯廣平，遲廣明.七葉皂苷的藥理作用及其主要臨床應用［J］.中國藥師，2004，7（3）：206-208.

［3］萬貴平，張真真.七葉皂苷鈉抑制人白血病Jurkat細胞增殖的機制研究［J］.中草藥，2012，43（1）：106-109.

［4］成志，高瑞蘭.七葉皂苷誘導HL-60細胞凋亡的研究［J］.中國實驗血液學雜志，2008，16（2）：290-293.

［5］Popadic S，Popadic D，Ramic Z，et al.Chloramphenicol induces in vitro growth arrest and apoptosis of human keratinocytes［J］.Cell Biol Toxicol，2006，22（5）：371-379.

［6］Van Engelang M，Nielang LJ，Ramaekers FC，et al.Annexin V affinity assay：a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure［J］.Cytometry，1998，31（1）：1-9.

［7］Saraste A，Pulkki K.Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis［J］.Cardiovasc Res，2000，45（3）：528-537.

［8］Youle RJ，Strasser A.The BCL-2 protein family:opposing activities that mediate cell death［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（1）：47-59.

Apoptosis of Human Acute Monocytic Leukemic SHI-1 Cells Induced by Sodium Aescinate

WANG Shao juan1,LIN Xiaojie2,YIN Liming2,GAO Ruilan2.1 Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310053),China;2 The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University

ObjectiveTo investigate the effects of sodium aescinate on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of human acute monocytic leukemic SHI-1 cells.MethodsProliferation of sodium aescinate treated SHI-1 cells was detected by MTT method.The apoptosis rates of SHI-1 cells were analyzed by flow cytometry after annexinⅤ/PI staining.The gel electrophoresis of DNA ladder was used to analyze the bands of DNA degradation,and the expression level of caspase-3 mRNA was tested by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.ResultsMTT assay showed that the proliferation of SHI-1 cells was effectively inhibited by sodium aescinate in a time-and-does dependent manner（P<0.05）.The AnnexinⅤpositive rate of SHI-1 cells after treated with sodium aescinate was significantly increased by FCM analysis（P<0.05）.The apoptosis typical DNA fragments of SHI-1 cells treated with sodium aescinate was presented on the gel electrophoresis.The expression level of caspase-3 mRNA was up-regulated with increasing concentration of sodium aescinate by RT-PCR detection（P<0.05）.ConclusionTreatment with sodium aescinate can have inhibitory effect on proliferation and induce apoptosis of SHI-1 leukemia cells.Our results provides an experimental evidence for the activity of sodium aescinate on anti-leukemia.

SHI-1 cells；apoptosis sodium；aescinate

2013-07-21