Livin和VEGF在甲狀腺癌中的表達及與臨床病理因素的相關性

白建平 張 霆 秦大偉

(解放軍254醫院普通外科，天津 300142)

甲狀腺癌是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%〔1〕。細胞增殖與凋亡失衡導致了腫瘤的發生，腫瘤細胞凋亡調節失調造成的細胞凋亡抵抗是腫瘤發生的主要原因之一〔2〕。凋亡抑制蛋白(Livin)是新發現的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的一員，其過度表達導致的凋亡不足和腫瘤的發生、發展有關〔3〕。血管內皮生長因子(VEGF)是一種高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂素，可以刺激血管內皮細胞增殖、遷移并誘導新生血管生成，積極參與甲狀腺腫瘤的生長和浸潤過程〔4〕。本研究利用免疫組化的方法分析VEGF和Livin在甲狀腺癌組織中的表達及其與甲狀腺癌的臨床病理特征的關系，為臨床上診療甲狀腺癌提供理論支持。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取2011年1月至2013年6月于我院進行手術治療的甲狀腺疾病患者153例。經病理檢查確診為甲狀腺癌患者82例，在就診前均未行放射治療、化療治療，其中男27例，女55例，年齡34～76〔平均(42.1±13.9)〕歲；甲狀腺腺瘤患者16例，其中男5例，女11例，年齡32～74〔平均(41.9±14.6)〕歲；結節性甲狀腺腫患者33例，其中男12例，女21例，年齡27～75〔平均(38.9±17.6)〕歲；同期手術無癌侵犯的癌旁組織22例，其中男12例，女10例，年齡23～70〔平均(44.1±11.8)〕歲。對四組患者性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要試劑 鼠抗人VEGF單克隆抗體及免疫組化試劑盒購于福州邁新生物制品公司。兔抗人Livin蛋白多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1SP免疫組化法 操作步驟按試劑盒說明書進行，用石蠟將標本包埋后備用，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。每份標本取3份切片，石蠟標本組織連續性切片，切片厚4 μm，常規脫蠟、水化。行高溫高壓及微波抗原修復處理，一抗4℃過夜，加入抗一抗的二抗后常溫孵育30 min， 二氨基聯苯胺(DBA)顯色，顯色后再使用HE復染，中性樹脂脫水封固后判斷結果。用試劑公司提供的強陽性標本切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.3.2觀察指標 在400倍光鏡下判斷結果，每份切片取10個高倍鏡視野采取雙盲法閱片，觀察記錄切片中陽性細胞占同類觀察細胞總數的百分比和其著色強度。陽性細胞的判定標準：棕黃色顆粒主要位于細胞核內，或者胞核伴胞質內，若只有胞質出現棕黃色為非特異性染色。染色強度評分標準：無色判為0分，淡黃色判為1分，棕黃色判為2分，棕褐色判為3分；陽性細胞所占的百分比計分標準：陰性計為0分，陽性細胞 ≤10%計為1分，陽性細胞11%～50%計為2分，陽性細胞51%～75%計為3分，陽性細胞>75%計為4分。切片陽性判斷標準為染色強度與陽性細胞百分比的分值乘積3分或以上。

1.4統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，VEGF和Livin表達的相關性采用Spearman等級相關進行分析。

2 結 果

2.1VEGF和Livin在不同甲狀腺組織中的表達情況 VEGF、Livin在不同甲狀腺組織中的表達存在差異(P<0.05)，其中甲狀腺癌組織中VEGF、Livin表達最高。見表1。

表1 VEGF和Livin在不同甲狀腺組織中的表達〔n(%)〕

2.2VEGF的表達與甲狀腺癌患者臨床病理指標及與Livin表達的關系 VEGF的表達與甲狀腺癌病理類型、TNM分期、是否伴隨淋巴結轉移及Livin表達有關(P<0.05)。見表2。

2.3Livin和VEGF在甲狀腺癌組織表達的相關性 由Spearman相關性檢驗結果可見，在甲狀腺癌組織中，Livin和VEGF的表達呈正相關關系(r=0.421，P=0.000)。其中Livin(-)，VEGF(-)16例；Livin(-)，VEGF(+)13例；Livin(+),VEGF(-)8例；Livin(+)，VEGF(+)45例。

表2 VEGF的表達與甲狀腺癌患者臨床病理指標及與Livin表達的關系

3 討 論

Livin基因位于人第20號染色體上，全長46 kb，包括7個外顯子和6個內含子，Livin的抗凋亡活性主要依賴于其桿狀病毒IAP重復區(BIR)的結構域，Livin的BIR結構和其他IAP成員類似，包含4個α螺旋、1個三股反向平行的β片層結構及一些相應的氨基酸殘基，這三個結構上的突變會造成Livin生物學作用的變化，改變其抗凋亡的活性〔5, 6〕。Livin的BIR結構域和環指結構還是泛素化的靶點及隨后的水解位點。Livin抑制腫瘤細胞凋亡的機制包括：(1)直接抑制easpase或procaspase；(2)轉化生長因子(TGFP)激活激酶(TAKl)依賴的c-Jun氯基末端激酶(JNKl)的激活；(3)Livin的抗凋亡作用還受到線粒體釋放的caspase活化蛋白(SMAC)的調節〔7～9〕。

VEGF可以在生理或病理情況下促進血管生成, 可以增強血管內皮細胞有絲分裂活性,并促進內皮細胞的活化與遷移,是最重要的一種促血管生成蛋白〔10, 11〕。研究發現,VEGF及VEGF-mRNA在很多實體癌如宮頸癌、肺非小細胞癌等組織中表達較正常組織明顯升高并和預后有密切關系〔12, 13〕。本研究結果提示VEGF的高表達是甲狀腺癌生物學行為活躍的風向標，預示著高侵襲性及易轉移性，甲狀腺組織中VEGF的高表達可以作為甲狀腺癌診斷和預后判斷的有效指標之一〔14〕。

本研究發現，VEGF、Livin主要在甲狀腺細胞中表達，其高表達可能和甲狀腺癌的發生發展有關。在甲狀腺癌組織中，提示Livin和VEGF在甲狀腺癌的局部浸潤、遠處轉移及血管生成過程中具有協同作用。

總而言之，VEGF及Livin異常表達可能和甲狀腺癌發生發展有關，可應用于臨床診治甲狀腺癌患者和判斷預后。

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