子宮內膜樣腺癌患者血清及組織人附睪蛋白表達及其臨床意義

張丹鳳 孫盛梅 竇鵬揮 肖曉超 宋繼榮 胡玉紅

(佳木斯大學附屬第一醫院婦產科，黑龍江 佳木斯 154002)

子宮內膜癌分子發生機制尚不清楚。Galgano等〔1〕應用mRNA雜交及免疫組織化學檢測發現人附睪蛋白(HE)4在子宮內膜癌中的陽性率為90%，Huhtinen等〔2〕檢測發現HE4在子宮內膜癌中的表達率明顯高于健康對照組，迄今為止，子宮內膜癌沒有有效的監測指標。HE4在子宮內膜癌組織中的研究在國內尚未見報道，本研究旨在通過對正常女性及子宮內膜樣癌患者HE4血清及蛋白的測定，分析其與臨床病理及預后的相關性。

1 材料與方法

1．1研究對象 2009年9月至2010年3月我院婦科經病理檢查確診的60例子宮內膜癌患者為子宮內膜癌組,年齡34～84歲，平均年齡(54.19±11.46)歲，按照2003年國際婦產科聯盟(FIGO)臨床分期標準:Ⅰ期42例,Ⅱ期12例,Ⅲ期6例。絕經前49例，絕經后11例。組織分級G1：39例,G2～G3：21例。選擇我院同期正常子宮內膜組織18例(子宮肌瘤、子宮脫垂患者)，其中增生期10例，分泌期8例，為免疫組化對照組；健康體檢女性18人為血清對照組。子宮內膜非典型增生30例(輕度12例，中度 10例，重度8例)，年齡31～63歲,平均(48.68±11.38)歲。子宮內膜癌組術前均未應用任何激素治療,未行化療或放療。3組采血時均非月經期，并已排除關節炎、肝炎、近期感染、放化療及雌激素服用史。3組年齡無統計學差異(χ2=5.53,P=0.061)。所有子宮內膜癌患者血液標本取自術前2～3 d及術后1個月,子宮內膜增生組取治療前空腹肘靜脈全血3 ml，置于未加抗凝劑的真空采血管中,標本采集后剔除溶血標本，保存在4℃冰箱，3 d內3 000 r/min離心，10～15 min后取上清,分裝在聚丙烯EP管內，凍存在-80℃冰箱待測。

1.2血清HE4檢測 血清HE4 ELISA試劑盒為瑞典康乃格產品,用酶聯免疫吸附試驗(ELISA雙抗體夾心法)檢測。

1.3參考值和陽性判斷值 血HE4試劑盒提供的參考值為0～150 pmol/L,>150 pmol/L判斷為陽性。

1．4方法 HE4試劑盒(武漢萬德力生化試劑技術有限公司),DAB 顯色試劑盒為美國 DA-KO 公司產品，購自上海基因公司。采用 EnVision兩步法進行免疫組化染色。所有標本均經 10%甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，常規脫蠟至水，高壓熱修復抗原，DAB 顯色。以PBS 代替一抗作空白對照，用已知陽性片作為陽性對照。具體步驟參照試劑盒說明書進行，HE4蛋白表達于腺腔面細胞膜棕黃色顆粒極性表達，視為正常表達，去極性、胞核、胞質中出現棕黃色顆粒視為陽性；對綜合染色強度和陽性腫瘤細胞的百分比進行分級。

1.5統計學處理 應用 SPSS13.0軟件進行χ2檢驗。血清HE4水平呈非正態分布,故以中位數及范圍表示總體水平,組間比較用秩和檢驗。相關性用Spearman等級分析。

2 結 果

2.1HE4在3組中及子宮內膜癌不同分期的表達水平 子宮內膜癌組血清HE4 的陽性率顯著高于子宮內膜不典型增生組和正常子宮內膜組(P<0.001) ，而子宮內膜不典型增生組和正常子宮內膜組陽性率差異無統計學意義(P= 0.35)。見表1，圖1。血清HE4在子宮內膜癌G1期組〔85.25(77～590.2)pmol/L〕與G2+G3組〔156.85(55～604.8)pmol/L〕差別顯著(P<0.000 1)。隨著臨床分期增加HE4水平增加。

表1 3組HE4血清表達水平

2.2不同子宮內膜病變組織中HE4蛋白表達 HE4蛋白染色位于細胞質，在相鄰的間質細胞無陽性染色。子宮內膜癌組顯示中度或強陽性染色，正常子宮內膜組大部分顯示弱陽性染色，HE4 蛋白陽性信號彌漫出現在瘤細胞胞質中，失去極性，且強度增加，呈異質表達(圖1)。子宮內膜癌組HE4 蛋白表達〔44例(73.3%)〕高于正常子宮內膜組〔3例(16.7%)〕 (P=0.016)。正常子宮內膜組與不典型增生內膜組〔11例(36.7%)〕差異無顯著性。子宮內膜樣腺癌組血清HE4陽性率顯著高于該組組織 HE4 陽性表達率(P<0.05)，見表2。

表2 子宮內膜樣腺癌患者血清與組織中HE4 表達〔n(%)〕

2.3子宮內膜癌患者術前血清中HE4的表達水平與不同臨床病理特征的關系 子宮內膜癌組術前血清HE4濃度與FIGO分期、組織分期的提高和肌層浸潤加深、細胞沖洗液是否陽性呈正相關(P<0.05);與HE4組織表達、淋巴結轉移、CA125濃度、絕經否無相關關系(P>0.05)。見表3。

2.4HE4在子宮內膜癌組術前、術后血清中表達水平的變化 子宮內膜癌組術后血清中HE4水平〔20.12(4.67～106.38)pmol/L〕明顯低于術前(Z=-4.98,P=0.001 6)。

表3 子宮內膜癌患者術前血清HE4表達水平與不同臨床病理特征的關系

正常子宮內膜組

子宮內膜不典型增生組

子宮內膜癌組G1期

子宮內膜癌組G2期

3 討 論

子宮內膜癌是女性生殖道最常見的三大惡性腫瘤之一，是原發于子宮內膜腺上皮的惡性病變，其中多數來源于內膜腺體的腺癌。在我國占女性惡性腫瘤的7%，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，歐美等發達國家占生殖道惡性腫瘤的首位，多發病于老年婦女，但近些年有低齡化的趨勢，并且5年生存率也逐年降低，早期發現和早期治療能極大地提高5年生存率，改善預后，因此子宮內膜癌的早期診斷對有高危因素的人群意義更重大，尤其是嚴重肥胖、糖尿病、乳腺癌術后長期口服他莫西芬的患者。HE4是Kirchhoff等〔3〕1991年從人附睪上皮內發現的。Galgano等〔1〕研究發現HE4主要分布于生殖系統上皮如附睪、曲細精管、輸精管上皮、輸卵管上皮和子宮內膜,子宮內膜癌組織中90%HE4表達都是強陽性的,并且與組織病理類型無關,這一發現提示HE4可能是子宮內膜癌的標記物，Brennan等〔4〕研究也證實這一點。

本研究HE4從組織蛋白水平及血清水平分別檢測結果與國外的研究基本一致〔5，6〕。Huhtinen等〔2〕檢測發現子宮內膜癌患者血清HE4中位數(99.2 pmol/L)明顯高于健康對照(P<0.001)。Moore等〔7〕檢測了171例子宮內膜癌患者的術前血清HE4水平,發現健康對照組血清HE4中位數是35.4(18.0～127.8)pmol/L,子宮內膜癌患者血清HE4中位數是71.5(1.1～4 062.7)pmol/L,差異有統計學意義。本實驗研究發現HE4在子宮內膜癌組織中高表達，與正常組及子宮內膜不典型增生組有顯著差異，與Drapkin等〔8〕研究結果一致。但與血清相應樣本表達不完全一致，血清HE4表達陽性率明顯高于組織。可能與樣本量小或腫瘤組織中的不同成分干擾影響有關，但血清學樣本HE4在子宮內膜癌早期即明顯升高，說明血清HE4水平可以用于子宮內膜癌的早期輔助診斷。FIGO分期是影響子宮內膜癌患者預后的明確因素,本研究說明HE4可能促進細胞向惡性轉化，是一個逐漸積累漸進的過程，提示HE4可能與子宮內膜癌的發生發展有關，檢測子宮內膜癌中HE4的表達，有助于對具有進一步惡變傾向的子宮內膜病變進行早期診斷，早期治療。血清HE4水平高低可在一定程度上用于術前評估及反映患者的預后,說明HE4可以作為評估預后的一個指標，這與Angioli 等〔9〕研究結果一致，應進一步確定其檢測陽性區間范圍指導臨床。同時血清HE4水平檢測可以用于子宮內膜癌療效評價。術后隨訪中如果發現HE4升高應該考慮子宮內膜癌復發,HE4是否能作為一個早期發現復發的客觀指標還需要進一步驗證。

4 參考文獻

1Galgano MT,Hampton GM, Frierson HF Jr.Comprehensive analysis ofHE4 expression in normal and malignant human tissues〔J〕.Mod Pathol,2006;19(6):847-53.

2Huhtinen K, Suvitie P,Hiissa J,etal.Serum HE4 concentration differentiates malignant ovarian tumours from ovarian endometriotic cysts〔J〕.Br J Cancer,2009;100(8):1315-9.

3Kirchhoff C，Habben I，Ivell R，etal． A major human epididymis-specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors〔J〕.Biol Reprod，1991;45(2):350-7.

4Brennan DJ, Hackethal A, Metcalf AM.Serum HE4 as a prognostic marker in endometrial cancer--a population based study〔J〕.Gynecol Oncol,2014;132(1):159-65.

5Kalogera E,Scholler N,Powless C,etal.Correlation of serum HE4 with tumor size and myometrial invasion in endometrial Cancer〔J〕.Gynecol Oncol,2012;124(2):270-5.

6Bignotti EI, Ragnoli M, Zanotti L,etal.Diagnostic and prognostic impact of serum HE4 detection in endometrial carcinoma patients〔J〕.Br J Cancer,2011;104(9):1418-25.

7Moore RG,Brown AK,Miller MC,etal. Utility of a novel serum tumor biomarker HE4 in patients with endometrioid adenocarcinoma of the uterus〔J〕.Gynecol Oncol,2008;110(2):196-201.

8Drapkin R, von Horsten HH,Lin Y,etal. Human epididymis protein 4 (HE4) is a secreted glycoprotein that is overexpressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas〔J〕.Cancer Res,2005;65(6):2162-9.

9Angioli R, Miranda A, Aloisi A,etal.A critical review on HE4 performance in endometrial cancer:where are we now〔J〕.Tumour Biol,2014;35(2):881-7.