RNAi沉默VEGF-C對A549細胞VEGF家族因子及其受體和下游信號通路的影響

宋秋穎 張增雷 張 偉 潘艷明 任鳳云 馮玉寬

(牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011)

血管和淋巴管新生的程度是實體腫瘤無限增殖、復發和轉移潛能大小的直接影響因素之一，更是腫瘤細胞自給式生長的重要機制之一，同時亦是包括肺癌在內的許多惡性腫瘤的主要惡性表型之一〔1,2〕。目前，多數實體腫瘤的靶向治療就是基于阻斷血管和淋巴管新生理論產生的。盡管如此，實體瘤血管和淋巴管新生在分子水平調控機制并不十分清楚。本研究以血管內皮生長因子(VEGF)-C為靶點，研究通過RNA干擾技術沉默A549細胞VEGF-C 基因表達對VEGF家族因子及其受體和下游信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1細胞株及主要試劑 人非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系A549購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，細胞起源于美國模式培養物集存庫(ATCC),用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基培養(美國Invitrogen 公司)。PSIH1-H1-copGFP shRNA Vector及慢病毒載體系統為美國System Biosciences公司產品;TRIzol 試劑、內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 連接酶、反轉錄試劑盒及感受態細胞購于大連TaKaRa公司;抗VEGF-C、 VEGF-A、VEGFR-2、VEGFR-3、pVEGFR-2抗體購于美國Santa Cruz公司，p-VEGFR-3、p-ERK1/2、p-AKT、p-p38、ERK1/2、AKT、p38、GAPDH 抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，二抗均購于美國Santa Cruz公司，蛋白提取試劑、蛋白定量試劑盒及ECL發光試劑盒購于美國Pierce公司，PVDF膜購于美國Millipore 公司;ELISA檢測試劑盒Quantikine Human VEGF-C Enzyme-Linked Immunoassay 購于美國R&D公司。

1.2構建靶向VEGF-C 基因的干擾質粒pSIH1-H1-copGFP-VEGF-C 根據VEGF-C(NM005429) mRNA 序列信息，使用siRNA Target Finder在線siRNA序列設計軟件，設計針對其CDS 區的siRNA 序列:5′- CCTCAGCAAGACGTTATTT -3′，根據siRNA序列，設計兩條互補的DNA模板單鏈，模板鏈包括siRNA的正義鏈和反義鏈，中間以12個脫氧核苷酸的Loop結構(5′-CTTCCTGTCAGA-3′)相連，后面接有RNA PolyⅢ聚合酶轉錄終止位點(TTTTT)，同時模板鏈兩端分別添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，退火形成互補雙鏈DNA。pSIH1-H1-copGFP shRNA 質粒雙酶切后與上述退火產物連接，連接產物轉化TOP10 感受態細菌，37℃過夜培養。挑取單菌落接種LB 培養基，37℃、300 r/min搖床培養16 h，提取pSIH1-H1-copGFP-VEGF-C質粒，測序并進行序列分析。

1.3重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C的包裝和生產 使用含10% FBS的DMEM培養液培養293TN細胞(System Biosciences，Cat. # LV900A-1)，0.6 ml胰酶消化傳代，取對數生長期細胞接種至10 cm貼壁細胞培養皿上，每皿接種數目為1.5×106個，接種24 h后，細胞貼壁密度約為85%，細胞梭型，中央發亮，形態飽滿，適合轉染實驗。使用LipofectamineTM 2000 轉染試劑轉染，質粒用量為Lentivirus Package plasmids mix(500 ng/μl)，22 μl；Lv-VEGF-C siRNA plasmid DNA(500 ng/μl)，4 μl；轉染試劑用量每10 cm培養皿為40 μl。轉染后48 h，鏡下觀察細胞液發黃，貼壁細胞密度約為90%，細胞扁平，貼壁狀態較好。收集細胞上清，5 000 r/min離心5 min，去掉細胞碎片沉淀，然后使用0.45 μm的PVDF膜過濾上清液，冰浴條件下過夜保存；梯度稀釋法進行重組慢病毒滴度測定，使用dPBS(pH7.8,實驗室配制)將病毒顆粒濃度調整至1×104ifu/μl，按1 ml每管濃度調整后的病毒液進行分裝，-70℃保存待用。所收集的病毒分別命名為Lv-siRNA-VEGF-C組和Lv-Con(空載質粒組)。

1.4重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549細胞 接種處于對數生成長期的A549細胞到96孔細胞培養板，每孔1.0×104個細胞，分別加入100、50、40、30、20、10 μl標準copGFP標記的病毒液(1×104ifu/μl)感染A549細胞，換液后72 h，熒光倒置顯微鏡下觀察，綠色熒光表達比較穩定，使用胰酶消化的方法對細胞進行計數，進行數據分析，確定細胞感染效率達到100%時最少病毒用量，計算最佳MOI 值。按照最佳MOI添加病毒液，同時設Lv-Ctrl 組和未轉染組，37℃和5% CO2的條件下正常培養。放大培養細胞克隆，挑取最穩定的克隆進行傳代培養，并且收集不同代數的細胞進行Western印跡檢測。

1.5Western印跡法檢測細胞VEGF-C及VEGF家族因子和信號通路的蛋白表達 分別收集Lv-siRNA-VEGF-C細胞和對照組細胞1.5×106個，加入4℃預冷的蛋白裂解液充分裂解，4℃條件下12 000 r/min 離心15 min，收集上清使用BCA法進行總蛋白濃度檢測。進行SDS-PAGE電泳，轉膜，常溫封閉2 h，TBST 緩沖液沖洗2遍，分別加入VEGF-C,VEGF-A,VEGFR-2,VEGFR-3,pVEGFR-2,p-VEGFR-3,p-ERK1/2,p-AKT,p-p38,ERK1/2,AKT,p38,GAPDH一抗，4℃過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入二抗后室溫反應1 h;TBST 洗膜3次，每次10 min。曝光、顯影、漂洗、再定影。采用灰度掃描軟件TotalLab進行膠片掃描，分析檢測結果。

1.6ELISA法檢測細胞VEGF-C蛋白的分泌 取96孔培養板培養細胞上清液，每孔取100 μl，4℃和3 000 r/min離心2 min，去除細胞碎片。加入100 μl of Assay Diluent RD1W。然后分別設空白孔、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中加入待測上清液50 μl，使用封板膜封板后置室溫搖床500 r/min條件處理2 h；使用Wash Buffer洗板4次，無菌吸水紙上倒置拍板，盡量甩出孔中殘留的洗液；每孔加入200 μl VEGF-C Conjugate，使用新的封板膜重新封板，室溫500 r/min搖床處理；每孔添加200 μl Substrate Solution,室溫避光孵育30 min；每孔加終止液50 μl Stop Solution，終止反應。以空白孔調零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。

2 結 果

2.1重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 成功感染A549細胞 對重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C測序結果表明，插入片段與設計的VEGF-C shRNA核苷酸序列完全一致，未發現有突變、缺失、插入等異常存在，表明已經成功構建靶向VEGF-C 基因的重組慢病毒載體Lv-siRNA-VEGF-C。將重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549細胞，慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549 細胞的效率達90%(圖1)。

圖1 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染A549細胞(×200)

2.2重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染下調A549細胞中VEGF-C蛋白的表達和分泌 慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染后，A549 細胞中VEGF-C 蛋白的表達量明顯降低。與未感染組A549細胞相比，慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染后，A549細胞中VEGF-C 蛋白的表達水平〔( 0.23±0. 02) vs( 0.54±0.03),P<0.01〕和72 h的蛋白分泌水平〔(764.90±204.33) pg/ml vs (3 355.06±256.93) pg/ml〕明顯降低。見圖2。

1)P<0.05，2)P<0.01

2.3重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549細胞VEGF家族因子及其受體的表達 與未轉染的A549細胞相比，VEGF-A,VEGFR-2,VEGFR-3的蛋白表達在Lv-siRNA-VEGF-C細胞中明顯減少，分別減少了61.77%、57.30%和73.75%(P<0.001)。見圖3。

圖3 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染抑制A549細胞VEGF家族因子及其受體的表達

2.4重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549細胞VEGFRs磷酸化水平ERK、AKT和p38信號通路活性 VEGF-C RNA干擾可顯著降低VEGFR-2和VEGFR-3磷酸化水平，同時也降低了VEGFR-2和VEGFR-3介導的ERK1/2，AKT和p38-MAPK信號通路的磷酸化水平。見圖4。

圖4 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C 感染抑制A549細胞VEGFRs磷酸化水平和ERK、AKT和p38信號通路活性

3 討 論

在眾多調控因子中，VEGF-A、VEGF-C及其受體VEGFR-2和VEGFR3是腫瘤發生發展過程中，血管和淋巴管生成的主要因子，已經成為以病理性血管和淋巴管生成信號通路為標靶的腫瘤靶向治療的首選標靶〔3〕。近期的研究發現，VEGF-C及其受體VEGFR-3表達于許多惡性腫瘤細胞，并且證實許多腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移與VEGF-C和VEGFR-3組成的自分泌信號軸相關，而且VEGF-C除了傳統認為的參與腫瘤淋巴管生成之外，還是腫瘤增殖、侵襲和轉移的關鍵因子，具有多重生物學作用〔4，5〕。 本研究發現RNA干擾沉默VEGF-C基因表達可明顯抑制VEGF-C和VEGFR-3的表達，并同時抑制了VEGF-A和VEGFR-2的表達，而VEGF-A和VEGFR-2則是調控血管生成的關鍵信號軸。因此，VEGF-C與VEGF家族因子和受體之間存在著自分泌調控關系，這將為腫瘤侵襲和轉移的生物學特征提供新的實驗支撐材料。VEGF-C/VEGFR-3和VEGF-A/VEGFR-2信號軸分別被認為是調控淋巴管和血管生成的關鍵因素，因此，干擾VEGF-C基因的表達同時阻斷了上述兩條信號軸，那么，是否通過抑制VEGF-C基因表達可同時抑制腫瘤的血管和淋巴管生成，還有待進一步的實驗研究和證實。

許多研究顯示，AKT、ERK和p38信號分子的磷酸化是調控細胞增殖和生存的關鍵步驟。亦有研究顯示，通過抑制ERK和AKT信號通路可具有抑制肝癌發生發展和具有抗腫瘤血管生成作用〔6〕。在內皮細胞，VEGFRs介導的AKT、ERK和p38信號通路的激活已被廣泛認知。然而，在腫瘤細胞，VEGFRs介導的AKT、ERK和p38信號通路如何被激活及如何起作用少有報道。Morelli等〔7〕的研究證實，在胃腸腫瘤細胞，VEGFR抑制劑可抑制VEGFR的磷酸化水平，并且同時抑制了下游信號分子AKT和ERK的磷酸化水平。Svensson等〔8〕在乳腺癌細胞則發現ERK的磷酸化與VEGFR-2的表達相關。在肺癌細胞，Su等〔3〕發現人為去除VEGFR-3的激酶活性會導致p38MAPK的磷酸化水平降低，而不影響ERK的磷酸化水平。本研究顯示，RNA干擾沉默VEGF-C基因表達可同時明顯抑制AKT、ERK和p38信號分子的磷酸化活性，這將導致AKT、ERK和p38信號通路同時受到阻滯，進而抑制了上述信號通路在腫瘤細胞增殖、凋亡和血管、淋巴管生成方面發揮作用。

4 參考文獻

1Kerbel RS. Tumor angiogenesis〔J〕. N Engl J Med,2008;358:2039-49.

2Feng Y,Wang W,Hu J,etal. Expression of VEGF-C and VEGF-D as significant markers for assessment of lymphangiogenesis and lymph node metastasis in non-small cell lung cancer〔J〕. Anat Rec(Hoboken),2010;293:802-12.

3Su JL,Yang PC,Shih JY,etal.The VEGF-C/Flt-4 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells〔J〕. Cancer Cell,2006;9:209-23.

4Li D,Xie K,Ding G,etal.Tumor resistance to anti-VEGF therapy through up-regulation of VEGF-C expression〔J〕. Cancer Lett,2014;346:45-52.

5Kerbel RS. Tumor angiogenesis:past,present and the near future〔J〕. Carcinogenesis,2000;21:505-15.

6Huynh H. AZD6244(ARRY-142886) enhances the antitumor activity of rapamycin in mouse models of human hepatocellular carcinoma〔J〕. Cancer,2010;116:1315-25.

7Morelli MP,Brown AM,Pitts TM,etal.Targeting vascular endothelial growth factor receptor-1 and-3 with cediranib(AZD2171):effects on migration and invasion of gastrointestinal cancer cell lines〔J〕. Mol Cancer Ther,2009;8:2546-58.

8Svensson S,Jirstrom K,Ryden L,etal.ERK phosphorylation is linked to VEGFR2 expression and Ets-2 phosphorylation in breast cancer and is associated with tamoxifen treatment resistance and small tumours with good prognosis〔J〕. Oncogene,2005;24:4370-9.