芹菜素對膀胱癌T24細胞增殖、凋亡和CyclinD1、 Caspase-3表達的影響

高瑞林 李毅寧 張建育 郭一泓

(福建醫科大學附屬第二醫院泌尿外科，福建 泉州 362000)

膀胱癌治療多采用保留膀胱的經尿道電切術進行治療。而保留膀胱的各種手術治療后，約的患者在2年內腫瘤可能復發，故常采用術后膀胱內藥物灌注治療以預防其復發，但卻存在不同程度的多藥耐藥。芹菜素，又稱芹黃素、洋芹素，廣泛分布于溫熱帶的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量為高；在一些藥用植物如車前子、絡石藤等中也有很高的含量，植物源性飲料如茶、酒以及一些調味品中也有分布。芹菜素是一種植物黃酮類化合物，具有多種生物學活性和藥理作用，它具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、鎮靜等作用〔1〕，尤其在抗腫瘤方面，包括抗乳腺癌〔2〕、宮頸癌〔3〕、卵巢癌〔4〕、胰腺癌〔5〕、肝癌〔6〕、胃癌〔7〕、白血病等〔8〕。其抗腫瘤機制復雜，主要是抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，干擾腫瘤細胞的信號轉導，誘導腫瘤細胞凋亡、降低腫瘤細胞的多重耐藥性以及減少抗腫瘤藥物(如絲裂霉素和環磷酰胺等)對正常細胞的毒性等〔9〕作用，為預防膀胱癌術后復發提供了一種新選擇。本文通過研究芹菜素對膀胱癌T24細胞增殖、凋亡及CyclinD1、Caspase-3表達的影響來探討芹菜素抗膀胱癌的機制。

1 材料與方法

1.1材料 T24人移形細胞膀胱癌細胞，購自中國科學院上海細胞生物學研究所(Shanghai Institute of Cell Biology，Chinese Aeademyof Seienees)。芹菜素，中國藥品生物制品檢定所(批號：111901-201102)；CyclinD1、Caspase-3抗體，美國Santa Cruz公司；胎牛血清(FBS)， RPMI 1640，胰蛋白酶為Gibco BRL公司；DMSO購自Amresco 公司；CCK-8試劑盒，同仁化學研究所；TRIzol、ECL化學發光試劑盒，Invitrogen 公司。PVDF膜(Millipore公司)，BCA蛋白測定試劑盒(Pierce公司，美國)。其余試劑均為進口或國產分析純。

1.2細胞培養 T24細胞培養使用的是含10%小牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ ml鏈霉素的RPMI-1640培養基，在5%CO2、飽和濕度、37 ℃孵箱中培養，更換培養液，待細胞生長至貼滿培養瓶壁時，用0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期細胞用于實驗。

1.3CCK8測定細胞增殖 收集對數生長期T24膀胱癌細胞制備成密度為1×106的細胞懸液，接種于96孔板(100 μl/孔)，置于培養箱培養24 h(37℃，5%CO2)。然后加入芹菜素(終濃度0，25，50，75，100 μmol/L，每組細胞設6個復孔)，分別培養24，48，72 h。吸除培養基，并用PBS洗滌細胞兩次后加入新的培養基，然后加入10 μl CCK8溶液。置于細胞培養箱內繼續孵育1 h，采用酶標儀在450 nm波長處測定OD值。加入相應量細胞培養液和CCK8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白獨照。細胞增殖率(%)=〔A(加藥)-A(空白)〕/〔A(加藥)-A(空白)〕×100。

1.4流式細胞術檢測芹菜素對T24細胞周期及凋亡的影響 收集對數生長期的T24細胞106/孔接種于6孔細胞培養板中。培養24 h后，分別用0，50，75，100 μmol/L的芹菜素處理細胞48 h，各組均設3個復孔。①用不含EDTA的胰蛋白酶收集處理后的細胞，800 r/min(r=12 cm) 離心10 min，沉淀采用300 μl PBS重懸，逐滴加入700 μl預冷的無水乙醇中，乙醇終濃度為70%，4 ℃避光固定過夜。離心10 min，去上清。PBS洗兩次。重懸細胞于500 μl 含100 U/ml的RNase A的PBS緩沖液中，避光，37℃孵育30 min。加2 mg/ml PI至終濃度50 μg/ml，避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞周期。②以無EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶收集上清漂浮細胞和底壁細胞。加200 μl上樣緩沖液重懸，加入2 μl Annexin-FITC，5 μl PI，孵育后行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5Western印跡檢測CyclinD1、Caspase-3的蛋白表達 收集對數期細胞制備成密度1×106個/ml的細胞懸液，接種于24孔板(100 μl/孔)，加入0，50，75，100 μmol/L共孵育48 h，用RIRP裂解液裂解細胞并提取總蛋白。用BCA法測定測定所提取蛋白的濃度，置于-20℃保存備用。取蛋白50 μg進行SDS聚丙烯胺凝膠電泳后，轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入第一抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜(10 min×3)；加入二抗室溫孵育60 min，用TBST洗10 min×3次；再用TBS洗膜10 min。ECL浸泡后X片曝光，分析結果。所用內參為β-actin。

2 結 果

2.1對T42細胞的生長抑制作用 CCK-8結果顯示不同濃度的芹菜素(0，25,50,75,100 μmol/L)作用于細胞后，在各時間點對T42細胞的增殖均有抑制作用，見表1。隨著芹菜素濃度增加細胞死亡率增加，細胞毒作用呈明顯的時間和劑量依賴性。與對照組相比，50 μmol/L以上濃度藥物可明顯抑制T24細胞增殖(P<0.05)；藥物濃度低于25 μmol/L時對細胞抑制作用不明顯，與對照組無明顯差異。根據該試驗結果，選取50，75，100 μmol/L芹菜素濃度進行后續實驗。

2.2芹菜素對T-24細胞凋亡的影響 50、75、100 μmol/L芹菜素溶液作用于膀胱癌T24細胞48 h后，呈濃度依賴性改變細胞周期分布，一方面降低G2/M期的細胞比例，另一方面增高G0/G1期細胞的比例，說明芹菜素可能通過阻滯細胞在G0/G1期來抑制細胞增殖。見表2。同時經流式細胞術檢測，與空白對照組相比芹菜素處理各組細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；細胞凋亡率隨著藥物濃度增加而增加，各濃度藥物處理組之間細胞凋亡率差異也具有統計學意義(P<0.05)。

表1 芹菜素作用于T24細胞24、48、72 h后對其增殖的影響(%)

表2 不同濃度芹菜素作用膀胱癌T24細胞后細胞周期分布(%)

2.3芹菜素對CyclinD1和Caspase-3蛋白表達的影響 用50、75、100 μmol/L芹菜素分別作用T24細胞48 h，Western印跡法檢測各濃度組CyclinD1和Caspase-3蛋白表達水平的差異見表3，圖1。芹菜素能劑量依賴性抑制CyclinD1表達，同時增強Caspase-3表達。CyclinD1和Caspase-3蛋白免疫印跡條帶分別和內參條帶進行灰度比。各組進行統計學處理，與對照組相比，各組間有顯著差異(P<0.05)。各組間差異具有統計學意義， 蛋白表達水平隨用藥濃度增加而升高， 蛋白表達水平隨用藥濃度降低。

圖1 Western 印跡檢測CyclinD1和Caspase-3蛋白表達

表3 Western 印跡檢測CyclinD1和Caspase-3蛋白表達(%)

3 討 論

膀胱癌發病率居惡性腫瘤的第9位〔10〕。在我國，男性膀胱癌發病率位居全身腫瘤的第8位，女性排在第12位以后〔11〕，發病率遠低于西方國家。近年來，我國部分城市腫瘤發病率報告顯示膀胱癌發病率有增高趨勢〔12，13〕，其生物學行為復雜多變，突出表現為易復發、多發、浸潤和轉移等。膀胱癌的發生是多基因多步驟的復雜過程，已證明與多種抑癌基因異常表達有一定的相關性。細胞周期是細胞從上一次分裂結束開始生長到下一次分裂終了所經歷的過程，所需的時間即為細胞周期。分為G1、S、G2、M期。G1期是DNA合成前期，G2期是DNA合成后期，S期是DNA合成期，M期指有絲分裂期。惡性腫瘤通常表現為細胞分化能力降低、存活能力增加，從而引起分化不足和生長失控〔14〕。

Cyclin D1是細胞周期控制的關鍵因素之一，可與 CDK4，6結合，使細胞越過G1～S細胞周期檢查點，進入S期，多種腫瘤細胞 Cyclin D1過度表達，使G1期縮短，增殖速度加快，并可呈非絲裂原依賴性〔15，16〕。研究發現：CyclinD1在多種腫瘤中高表達，并且其表達與腫瘤的增殖活性和侵襲力有密切關系,也是判斷腫瘤預后的一個重要指標。CychinD1對多種腫瘤的發生發展有重要的作用,如：乳腺癌、食道癌、膀膚癌和肺癌〔17～20〕。CychinD1的高表達在癌癥中常見事件,但單獨作為基因擴增的結果不會發生。相反，CychinD1水平升高一般是有翻譯后水平調節缺陷引起的。這些研究表明，誘導CyclinD1降解可能為治療干預癌癥提供一個有效的途徑〔21，22〕。

Caspase-3是細胞凋亡反應中的執行者和關鍵酶〔23〕，直接參與介導細胞凋亡過程。Caspase-3編碼35 kD，由Fernandes-Alnemri T最早從人類的Jurkat T淋巴細胞中克隆出來的〔24〕。大多數情況下，Caspase-3是無活性的，以酶原形式存在于細胞質中，廣泛表達于多種腫瘤組織及正常人體組織，可通過內源性的線粒體通路和外源性的死亡受體通路這兩條途徑被激活〔25〕。活化后的Caspase-3再繼續激活Caspase-2，6，8，10等，級聯激活的caspases最終水解細胞骨架蛋白以及核酸，最后引起細胞凋亡〔26〕。

本研究發現，芹菜素呈時間及劑量依賴方式抑制膀胱癌T24細胞增殖，誘導T24細胞死亡。通過流式細胞術檢測結果可見，芹菜素誘導的膀胱癌T-24細胞死亡以凋亡為主，但并不排除壞死性細胞死亡。芹菜素可通過下調Cyclin D1使腫瘤細胞阻滯于G1期，從而抑制細胞增殖。同時，誘導細胞剪切活化型Caspase-3表達增高，直接剪切DNA，促使細胞凋亡。因此，芹菜素可以通過抑制Cyclin D1從而抑制細胞增殖，同時，還可以通過啟動Caspase-3等的表達或活化從而誘導凋亡，芹菜素對膀胱癌T24細胞具有抑制增殖和誘導凋亡雙重作用，這可能是芹菜素的抗腫瘤機制之一。但是其抑制腫瘤生長和誘導凋亡的確切作用機制目前尚未完全明確，因此對其機制的探討以及芹菜素更廣闊的使用價值還有待更深入研究。

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