復方莪術油微球肝動脈栓塞治療大鼠移植性肝癌的機制

周玲玲 袁冬平 張興德 許 立 方泰惠

(南京中醫藥大學藥學院 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210029)

原發性肝癌是我國常見的一種惡性腫瘤，肝動脈栓塞術是目前臨床采用的重要治療方法之一〔1，2〕。采用藥物微球經肝動脈介入，可栓塞至肝腫瘤的末梢動脈，具有栓塞和緩釋藥物的雙重功能。由于腫瘤細胞具有周期性特點，聯合用藥遠比單用一種藥物效果要好，課題組嘗試將抗腫瘤療效確切的莪術油和絲裂霉素聯合制成中西藥復方制劑，進行了前期的制備工藝研究，研制成符合肝動脈栓塞要求的復方莪術油微球(CCAO- MS)制劑，并建立了大鼠移植性肝癌模型，初步證實了對肝癌的治療作用，探討了其部分機制〔3～6〕。本文進一步探討其經肝動脈栓塞治療大鼠移植性肝癌對腫瘤組織增殖和凋亡的調控機制。

1 材料與方法

1.1藥品試劑、動物及細胞株 莪術油：橙黃色油狀液體，由南京中醫藥大學藥劑教研室提取；絲裂霉素：紫黑色粉末(無錫三和藥業提供)；空白微球(B-MS)，CCAO-MS南京中醫藥大學藥劑教研室提供，微球粒徑為(72.01±7.65)μm，平均載藥量為9.45%，體外藥物釋放符合一級釋放模型。末端脫氧核苷酸轉移酶介導化DUTP缺口末端標技技術(TUNEL)試劑盒(Roche 公司產品)。大鼠半胱氨酸天門氨酸蛋白酶(Caspase)-3一抗、增殖核抗原(PCNA)一抗、免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術有限公司)。SD大鼠，體質量200～300 g，雌雄各半；由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，使用許可證號：SCXK(蘇)2005-0018。大鼠Walker-256瘤株由南京中醫藥大學藥學院陸茵教授惠贈。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠移植性肝癌模型的建立、分組和給藥〔5，6〕SD大鼠，參照前期建立的方法復制大鼠移植性肝癌，成功復制的大鼠隨機分為三組，每組15只，即： ①生理鹽水組，肝動脈插管灌注0.2～0.3 ml生理鹽水；②B-MS組，按10 mg/kg體重經肝動脈插管灌注；③CCAO-MS組，按10 mg/kg體重經肝動脈插管灌注。于瘤塊移植后7 d，于胃十二指腸動脈上切一小口，以29 G胰島素注射器上行進入肝固有動脈。按以上分組及劑量分別灌注相應制劑。灌注后結扎胃十二指腸動脈近端，放開肝總動脈上的動脈夾。逐層縫合切口后外涂金霉素軟膏，分籠飼養。于治療7 d后處死動物，進行指標檢測。

1.2.2肝腫瘤組織凋亡檢測〔7〕每組各隨機選取5個樣本切片，采用TUNEL法檢測腫瘤組織原位凋亡情況。光鏡下觀察切片的染色反應，以細胞核有明顯棕黃色為陽性細胞。計數陽性細胞數并計算TUNEL陽性標記指數(TUNEL-LI)，即凋亡指數。TUNEL-LI=(表達陽性細胞數/總細胞數)×100%。

1.2.3PCNA的檢測 標本同上切片處理，按照試劑盒說明書免疫組織化學法檢測細胞PCNA的變化了解細胞增殖情況。

1.2.4腫瘤組織Caspase-3表達的檢測 標本同上切片處理，采用免疫組織化學法，參照說明書進行。顯微鏡下觀察，以細胞核或細胞質呈棕黃(褐)色為陽性細胞，各樣本進行評分0～3分：0分：陰性表達；1分：輕度表達；2分：中度表達；3分：重度表達。

2 結 果

2.1CCAO-MS對移植性肝癌大鼠肝腫瘤細胞凋亡的影響 經肝動脈灌注CCAO-MS后肝腫瘤凋亡明顯增多，細胞核內及少數胞質內出現棕色顆粒，凋亡細胞散在分布，細胞核固縮或正常，凋亡指數〔(33.4±7.37)%〕明顯高于生理鹽水組〔(3.62±1.75)%〕和B-MS組〔(5.92±2.04)%〕(P<0.01)。見圖1。

2.2CCAO-MS對移植性肝癌大鼠肝腫瘤表達PCNA的影響 生理鹽水組大鼠肝臟腫瘤組織PCNA表達較強；復方莪術油微球組大鼠肝臟內瘤組織內PCNA表達較弱。見圖2。

生理鹽水組 B-MS組 CCAO-MS組

生理鹽水組 B-MS組 CCAO-MS組

2.3CCAO- MS對移植性肝癌大鼠肝腫瘤表達Caspase-3的影響 生理鹽水組大鼠肝臟腫瘤組織Caspase-3表達(0.20±0.45)較低；CCAO-MS組(2.60±0.55)大鼠肝臟腫瘤組織內表達較B-MS組(0.60±0.55)及生理鹽水組增強(P<0.01)。見圖3。

生理鹽水組 B-MS組 CCAO-MS組

3 討 論

CCAO-MS制劑采用莪術油和MMC兩種藥物聯合應用，莪術是活血化瘀藥，其抗腫瘤作用受到廣泛關注，而且其可促進其他抗腫瘤藥物的吸收〔8〕；MMC具有非特異作用于腫瘤細胞增殖各個時期的特點。制成微球制劑肝動脈灌注給藥，針對性強，抗腫瘤同時可減少全身不良反應，課題組前期完成了CCAO-MS的制備工藝研究，并采用Walker-256瘤株成功復制了大鼠移植性肝癌模型，在此基礎上證實了其治療大鼠移植性肝癌較單用莪術油和MMC具有增效減毒作用〔4，5〕。

腫瘤的發生發展與細胞凋亡受阻密切相關，腫瘤組織除了增殖活性以外，同時還存在細胞凋亡。對于具有同等增殖能力的腫瘤而言，如果細胞凋亡率減少，將使腫瘤細胞凈生長率提高，預后則更差〔9，10〕。研究顯示CCAO-MS可阻滯腫瘤細胞SMMC-7721細胞株的細胞周期而抑制其增殖，并可促進腫瘤細胞的凋亡〔6〕，在此基礎上，本研究進一步觀察了CCAO-MS對移植性肝癌大鼠的肝腫瘤細胞的凋亡過程的影響。結果顯示：復方微球可明顯促進肝腫瘤細胞的凋亡，說明其可在肝臟腫瘤組織內發揮誘導腫瘤細胞凋亡的作用，從而進一步抑制其腫瘤組織的生長速度，這可能是其治療肝癌的機制之一。

細胞的增殖和凋亡涉及一系列基因的激活、表達及調控，在此過程中，PCNA、Caspase家族等均發揮了不同的作用〔11，12〕。PCNA是反映腫瘤細胞增殖活性的良好指標，而Caspase-3為關鍵的凋亡分子，在細胞凋亡早期的啟動與執行過程中起著重要作用〔13〕。本結果提示CCAO-MS的抗腫瘤作用可能與下調PCNA的表達和上調Caspase-3的表達有關。

綜上，CCAO-MS經肝動脈栓塞對大鼠移植性肝癌有明顯的治療作用，且可調控腫瘤增殖與凋亡的相關基因，其采用中西藥合用，較單用中藥和西藥均有獨特的優勢，具有良好的應用前景。

4 參考文獻

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