絞股藍總皂苷對阿霉素致心力衰竭大鼠心功能的影響

葛 敏 劉國平 關宿東

(蚌埠醫學院藥理學教研室,安徽 蚌埠 233003)

阿霉素(ADR)被廣泛用于治療實質性及血液系統惡性腫瘤，但隨著劑量的增加患者常伴有擴張型心肌病和充血性心力衰竭〔1,2〕,且預后很差，因而臨床應用受到限制。絞股藍屬于葫蘆科絞股藍屬植物，其主要藥效成分為絞股藍總皂苷(GP)。GP具有較強的抗氧化、抑制細胞內Ca2+超載〔3,4〕等多種藥理作用。本研究旨在探討GP對ADR致心力衰竭大鼠心臟功能的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠50只，體重(232±13)g，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供。

1.2實驗藥物和試劑 GP(純度90%)，購于惠州綠源公司；鹽酸ADR：浙江海正藥業有限公司生產(批號：070501)。ATPase試劑盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒和Ca2+-ATPase試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RT-PCR試劑盒：寶生物(大連)有限公司；Trizol 100ml/瓶：Invitrogen公司；Tris-HCl購自美國Promega公司；其余試劑均為國產分析純。

1.3動物模型制備 大鼠隨機分為五組，即正常對照組(NC)，ADR組,GP低、中、高劑量(L-GP、M-GP、H-GP)組，每組10只。具體處理如下：ADR給藥方法：除NC組外，其余各組均腹腔注射ADR，2.5 mg/kg體重，隔日1次，共6次，累積劑量15 mg/kg體重，NC組給予等容量的生理鹽水腹腔注射，隔日1次，共6次；GP給藥方法：GP低、中、高劑量組分別在注射ADR半小時前給予0.5%、1%、2%GP 10 ml·kg-1·d-1灌胃，共6 w；對照組等量的生理鹽水灌胃，1次/d，連續6 w。

1.4心功能測定 實驗第7周，20%烏拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，肝素化(1%肝素1 ml/kg股靜脈注入)，手術游離出右側頸總動脈，經其插入自制的心室插管(直徑1 mm，充滿1%肝素)，描記血壓曲線；再繼續插入左心室，描記室內壓曲線，自動分析處理左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、心室內壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)等數據。

1.5心肌組織ATPase和SDH活性測定 取其左心室肌，標本放置-80℃冰箱保存。心肌勻漿測定ATPase活性和SDH活性，蛋白定量采用考馬斯亮藍法，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6心肌肌漿網Ca2+-ATPase(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA2a)活性測定 ①心肌SR制備：按文獻〔5〕的方法制備心肌SR膜：取定量左心室組織置于4℃勻漿液(NaHCO310 mmol/L，NaN35 mmol/L，Tris-HCl 15 mmol/L，pH6.8)進行勻漿,經離心(9 500 r/min，20 min)去除細胞碎片，上清液再離心(19 000 r/min，45 min)，將沉淀懸浮于緩沖液(KCl 600 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L，pH6.8)中離心(19 000 r/min，45 min)，沉淀即為SR膜，懸浮于緩沖液(sucrose 250 mmol/L，histidine 1 mmol/L)。②心肌肌漿網蛋白測定：采用考馬斯亮藍法。心肌SERCA2a活性測定：采用無機磷酸根法。

1.7心肌超微結構觀察 大鼠處死時，取心尖部切成1 mm3小塊，2.5%戊二醛固定，電鏡觀察超微結構變化。

1.8逆轉錄-聚合酶(RT-PCR)半定量測定SERCA2a mRNA的表達 ①引物設計 β-actin(285 bp)：上游引物5′-TCATGAAGTGTGACGTTGA CATC CGT-3′,下游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCA CGATG-3′；SERCA2a(134 bp)：上游引物5′-AAGCAGTTCATCCGCTACCT-3′，下游引物5′-AGACCATCCGTCACCAGATT-3′，均由上海生工合成。②RT-PCR反應：取100 mg 組織采用Trizol 法提取心肌組織總RNA。反應體系20 μl ，包括10×PCR緩沖液2 μl，MgCl24 μl，dNTP(各10 mmol/L)2 μl，去DEPC水7.5 μl，Random 9 mers 1 μl, RNA酶抑制劑(40 U/μl) 1 μl，RNA 2 μl。反應條件:30℃10 min，50℃20 min，94℃5 min，5℃5 min然后進入PCR 循環，PCR反應體系40 μl：Taq 酶0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，去DEPC水28.75 μl，5×PCR緩沖液10 μl；94℃預變性2 min，94℃30 s，60℃30 s, 72℃2 min，循環30次。取PCR 產物5 μl于2 %瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統上掃描，測定SERCA2a mRNA和β-actin mRNA擴增產物的吸光度值，分別計算其比值。

2 結 果

2.1血流動力學指標的變化 與NC組相比，ADR組LVSP和±dP/dtmax均明顯下降，LVEDP上抬(P<0.05)，提示ADR致大鼠慢性心力衰竭模型成功，ADR組大鼠發生心肌損傷；與ADR組相比，GP各組LVSP和±dP/dtmax均有升高，其中M-GP、H-GP組LVSP和±dp/dtmax均顯著升高(P均<0.01)，LVEDP顯著下降 (P均<0.01)，表明中、高劑量GP對ADR致心臟毒性有較好的保護作用，可明顯改善心力衰竭大鼠的心臟收縮與舒張功能。見表1。

2.2心肌組織ATPase活性和SDH活性的變化 與NC組相比，ADR組心肌ATPase活性和SDH活性明顯下降(P<0.01)。GP中、高劑量組與ADR組比較，心肌組織中ATPase活性和SDH活性均升高(P<0.05，P<0.01)。與NC組相比，GP各組心肌組織中ATPase活性和SDH活性比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01) 。見表1。

2.3心肌超微結構變化 NC組：肌小節Z線排列整齊；線粒體形狀規則，嵴豐富，排列規則；細胞核完整。ADR組：心肌細胞內肌原纖維斷裂、溶解，肌漿網擴張，肌小節失去正常結構；線粒體水腫，嵴減少或消失，甚至空泡變。L-GP組：心肌肌原纖維尚整齊，部分橫紋不清；線粒體腫脹變性和局限性增多，部分嵴斷裂和溶解。M-GP組：肌小節灶性溶解，斷裂，部分橫紋模糊不清；肌漿網輕度擴張；線粒體大小不一，部分線粒體輕度水腫。H-GP組：心肌病變明顯減輕，肌原纖維排列整齊，無溶解、壞死等病變，僅部分線粒體水腫、空泡變。見圖1。

2.4心肌組織SERCA2a活性和SERCA2a mRNA表達的變化 與NC組相比，其余各組SERCA2a活性和SERCA2a mRNA表達均有顯著性下降(P<0.01)；與ADR組相比，M-GP和H-GP組SERCA2a活性和SERCA2a mRNA表達均增加(P<0.05，P<0.01)。見圖2和表2。

表1 GP對ADR中毒大鼠心功能、心肌組織SDH活性和ATPase活性的影響±s)

圖1 各組大鼠心肌超微結構(×12 000)

M:Marker；A：NC組；B：ADR組；C：L-GP組；D：M-GP組；E：H-GP組

表2 GP對ADR中毒大鼠心肌SERCA2a酶活性和mRNA表達的影響±s)

3 討 論

ADR最明顯的副作用之一是劑量依賴的不可逆轉的心肌病伴有充血性心力衰竭的擴張型心肌病〔1,2〕。ADR致心臟毒性具體機制尚不完全清楚，研究表明主要與脂質過氧化增強，細胞內鈣超載及細胞凋亡有關。實驗觀察到，ADR中毒后，其功能及形態學上的改變，可能是ADR使氧自由基生成增多，細胞膜產生脂質過氧化，造成質膜損傷，無法形成正常肌小節，對心肌細胞膜完整性具有損害作用〔5〕，從而損傷心肌收縮和舒張功能。

細胞內Ca2+轉運異常是心力衰竭患者心室收縮和舒張功能降低的主要原因，胞漿內鈣的超負荷可引起心肌收縮和舒張功能的異常。由于心肌線粒體內膜富含心磷脂，其DNA缺少組蛋白的保護，因而更易于受到氧自由基的攻擊而導致結構和功能損傷。線粒體是能量代謝的重要場所，ATP的產生和儲存在線粒體進行，心肌細胞幾乎全賴有氧代謝產生ATP以供細胞生存及做功的需要。當線粒體生成ATP減少，可導致ATP依賴性酶功能障礙。ADR可直接抑制Na+-K+-ATP 酶活性，使Na+-K+交換減少，Na+-Ca2+交換增加，從而增加鈣內流，誘發鈣超載〔6〕。在心肌細胞內Ca2+的調節中，SERCA2a起主要作用。心肌細胞收縮期間釋放到胞質的鈣離子60%～90%是由SERCA2a轉運入肌漿網內儲存〔7〕，由于大部分Ca2+由SERCA2a攝入肌漿網，導致心肌舒張，并為下一次收縮儲備Ca2+，因此SERCA2a在心肌舒、縮中起重要作用。肌漿網Ca2+-ATPase表達減低，鈣泵對胞質內Ca2+的攝取下降，造成細胞內Ca2+超負荷，心肌細胞不能有效地舒張〔8〕。SERCA2a表達的增高使Ca2+能在舒張期更快地回泵入肌漿網，從而加速心肌舒張的速度和心室總體舒張功能，使舒張末期壓降低，減少心肌的壓力和容量過負荷。ADR致心衰時，細胞內長期處于Ca2+超載狀態，細胞對Ca2+不敏感，導致收縮功能降低〔9,10〕。

本研究結果顯示GP給予預防性處理后，中、高劑量組大鼠心臟功能明顯改善，超微結構損傷減輕。進一步研究表明GP可能通過增加SERCA2a mRNA的表達，而增加SERCA2a活性；也可以抑制Ca2+內流〔3〕，從而調節了心肌細胞的鈣穩態；通過提高心肌組織ATPase活性、SDH活性而改善ADR對心功能的影響。綜上，GP是通過其抗脂質過氧化作用，增加SERCA2a mRNA的表達，抑制細胞內Ca2+超載起到保護作用，但具體機制有待進一步深入研究。

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