食管鱗癌中MDR1基因的表達與多藥耐藥的關系

劉 亮 左連富 郭建文

(河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所流式細胞室，河北 石家莊 050011)

目前認為腫瘤多藥耐藥產生與一類跨膜蛋白的產生有關，這類跨膜蛋白多為三磷酸腺苷結合轉運蛋白(ABC)〔1，2〕，研究較多的為ABCB1，又稱多藥耐藥1(MDR1)蛋白，由MDR1基因編碼。本研究檢測食管癌組織中MDR1基因表達水平，從而探討食管癌多藥耐藥產生與MDR1基因表達的關系。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集河北醫科大學第四醫院2008年1月至2009年11月食管鱗狀細胞癌手術切除標本150例，所有患者術前未接受過化療和放療。每例標本分別取癌組織、癌旁組織(距癌邊緣2～5 cm)及手術切緣正常食管黏膜(距癌邊緣5 cm以上)。術中立刻取新鮮食管癌組織、同個體癌旁食管組織及手術切緣正常食管組織，保存在液氮中。所有標本臨床病理資料完整，全部經病理檢查確診。從中選出80例食管鱗狀細胞癌、不典型增生和正常食管黏膜組織，用于RT-PCR的檢測，食管鱗狀細胞癌80例患者中男性55例，女性25例，年齡38～83歲，平均年齡(58.38±6.70)歲，中位年齡58.5歲。

1.2細胞株來源 人食管癌細胞株Eca109細胞本實驗室傳代培養。食管癌耐藥細胞株Eca109/ADM本實驗建立培養〔3〕。

1.3主要實驗儀器及試劑 PCR自動擴增儀，德國Eppendorf公司；Epics-XLⅡ型流式細胞儀，美國Beckman-Coulter公司；MDR1及GAPDH引物，上海生工生物工程公司。MDR1 抗體，北京中杉金橋生物技術有限公司；羊抗鼠FITC二抗(Lot:74628)，美國Jackson ImmunoResearch。

1.4RT-PCR方法檢測細胞中MDR1 mRNA表達水平 取生長狀態良好處于對數生長期的 Eca109、Eca109/ADM 細胞，或不同病變的食管組織，冷 PBS 洗滌 2 次，加入1 ml Trizol 試劑，常規一步法提取總RNA。RT-PCR 方法采用兩步法，MDR1上游引物5′-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3′，下游引物5′-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3′，擴增片段167 bp。GAPDH 上游引物5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，擴增片段452 bp。擴增條件為94℃5 min， 94℃30 s，58℃30 s， 72℃30 s，共 30 個循環， 72℃10 min。對擴增產物進行1.5%瓊脂糖電泳，溴乙啶染色，在凝膠成像分析儀下成像，用 Gel-proAnalyzer3.1 軟件分析擴增產物的光密度(OD) 值，計算MDR1 OD 值/GAPDH OD 值的比值，對MDR1mRNA表達強度進行光密度半定量分析。

1.5流式細胞術檢測細胞中MDR1蛋白的表達 取生長狀態良好，處于對數生長期的Eca109和Eca109/ADM細胞，冷PBS洗滌2次，用0.25%胰酶消化，4℃預冷的PBS緩沖液洗2遍細胞后，離心棄去上清液，冷磷酸緩沖液(PBS)將沉淀細胞重懸浮1×106個/100 μl，取單細胞懸液100 μl (含1×106個細胞)，加入1∶100稀釋的小鼠抗人MDR1抗體100 μl，室溫放置30 min，PBS洗滌細胞一次，棄上清，加入羊抗小鼠IgG-FITC二抗工作液100 μl，避光室溫放置30 min，PBS洗滌細胞1次，棄上清，上機檢測前加入PBS1.0 ml，經300目尼龍網過濾后上機檢測。在對免疫熒光標記物測定時，分別設PBS代替一抗和二抗的陰性對照，以及只加一抗或二抗的同型對照。FCM檢測細胞MDR1蛋白的表達量以平均熒光強度表示，實驗重復3次。

1.6熒光免疫細胞化學方法檢測細胞中MDR1蛋白表達及定位 將潔凈、消毒蓋玻片置于6孔板內，用0.25%胰蛋白酶消化單層培養腫瘤細胞(Eca109、Eca109/ADM)，調整細胞濃度將細胞按5×104/孔接種于6孔板，進行細胞爬片，將六孔板放置37℃、5% CO2的培養箱內常規培養，培養24 h待細胞貼壁后，棄去培養液，用4%多聚甲醛固定15 min，用PBS洗滌5 min×3次，0.1% TritonX-100作用10 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加正常山羊血清10 μl濕盒封閉30 min，傾去血清，滴加小鼠抗人MDR1抗體，室溫放置1 h，PBS洗滌5 min×3次，滴加羊抗小鼠IgG-FITC二抗，室溫避光放置1 h，PBS洗滌5 min×3次，激光共聚焦熒光鏡觀察細胞內MDR1蛋白熒光表達。

2 結 果

2.1不同食管病變組織中MDR1 mRNA表達水平 MDR1 mRNA在食管正常組織、不典型增生及癌組織表達水平分別為0.56±0.14、0.61±0.16、0.70±0.15，MDR1 mRNA在食管癌中的表達水平顯著高于正常及不典型增生組織(P<0.05)(圖1)。MDR1 mRNA在食管不典型增生Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級中的表達水平分別為0.55±0.20、0.58±0.11、0.68±0.17，不典型增生Ⅲ級中的表達水平顯著高于不典型增生Ⅰ級(P<0.01)。

M：DNA標準分子；A：正常組織；B：不典型增生；C：食管鱗癌

2.2食管癌組織中MDR1 mRNA表達與臨床病理特征的關系 食管癌組織中MDR1 mRNA表達水平，低分化者、浸潤深度達到纖維膜者、有淋巴結轉移者顯著高于中高分化者、浸潤深度未達到纖維膜者、無淋巴結轉移者(P<0.05)。年齡和性別之間表達量無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 食管鱗癌組織中MDR1 mRNA表達與臨床病理特征之間的關系±s)

2.3食管癌耐藥細胞Eca109/ADM中 MDR1 mRNA及蛋白表達 Eca109/ADM細胞中MDR1 mRNA及蛋白表達水平分別為0.71±0.05、525.68±16.56，與Eca109細胞中表達水平(0.50±0.06、472.85±11.34)相比顯著增高(P<0.05)。激光共聚焦熒光顯微鏡檢測結果顯示，MDR1蛋白主要表達在細胞膜及胞質，Eca109/ADM細胞中MDR1蛋白表達水平顯著高于Eca109細胞中的表達(圖2)。

圖2 激光共聚焦顯微鏡檢測細胞中MDR1蛋白表達

3 討 論

食管癌是我國較常見的惡性腫瘤，尤其在河北的磁縣和河南的林縣食管癌的發病率較高，嚴重影響了人們的生命健康，食管癌化療效果不佳，主要原因可能是由于多藥耐藥的產生。目前食管癌多藥耐藥發生的機制仍未闡明。研究發現，多藥耐藥的發生與一類跨膜蛋白的表達有關，這類跨膜蛋白多為ABC〔4，5〕，研究較多的為ABCB1及ABCG2(又稱BCRP)〔6～9〕。已有較多的研究報道MDR1及BCRP參與多種腫瘤的多藥耐藥的產生，但在食管癌中的研究較少。本課題在以往研究中發現，BCRP參與食管癌多藥耐藥的發生〔10，11〕。

實驗中利用RT-PCR的方法檢測了不同食管病變組織中MDR1 mRNA表達水平，結果顯示食管癌中MDR1 mRNA表達水平顯著高于不典型增生及正常組織，且在不典型增生Ⅰ級至Ⅲ級之間呈現逐漸增高趨勢，高表達MDR1的食管癌細胞可以外排化療藥物，降低細胞內化療藥物的有效濃度，從而逃逸化療藥物的殺傷，存活下來，參與食管癌多藥耐藥的形成。逃逸化療藥物殺傷的多藥耐藥細胞也可能成為食管癌復發的因素。MDR1在食管癌中的高表達可能參與了食管癌多藥耐藥的產生，檢測食管癌中MDR1表達水平可為食管癌患者化療方案的制定提供依據。

為進一步研究MDR1與食管癌多藥耐藥的關系，實驗中利用多種實驗方法檢測了食管癌多藥耐藥細胞中MDR1基因及蛋白的表達水平，結果提示，MDR1的高表達可能參與了食管癌多藥耐藥的發生。

綜合，MDR1的高表達與食管癌多藥耐藥的發生有關，為食管癌多藥耐藥逆轉的靶向研究提供作用靶點，為進一步闡明食管癌多藥耐藥機制提供實驗基礎。

4 參考文獻

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