肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌骨橋蛋白及其整合素β3受體表達(dá)的變化

王俊東 楊達(dá)寬 李治綱 李樹(shù)德

(昆明醫(yī)科大學(xué),云南 昆明 650500)

骨橋蛋白(OPN)是一種細(xì)胞黏附功能的分泌型糖基化磷蛋白，不僅是細(xì)胞外基質(zhì)也是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。整合素是一類(lèi)由α和β亞基組成的黏附分子，主要作用為介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞之間的黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中整合素αvβ3可識(shí)別并結(jié)合OPN，經(jīng)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將信號(hào)轉(zhuǎn)至胞內(nèi)，與細(xì)胞的遷移等生理活動(dòng)有關(guān)，在心血管病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要的作用〔1〕。正常心肌細(xì)胞OPN呈低表達(dá)狀態(tài)，但在病理狀態(tài)下OPN在心肌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，與心肌肥大和心室重塑有密切關(guān)系〔2〕。本研究通過(guò)觀察在肺動(dòng)脈高壓情況下OPN及其整合素β3受體基因在右心室心肌中的表達(dá)變化，探討其與右心室重塑的關(guān)系，為臨床診治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 選取體重250～300 g的60只二級(jí)雄性SD大鼠，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)等分為5組，1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組12只。

1.2試劑 Trizol-reagent RNA提取試劑盒、隨機(jī)引物和M-MLV和RNase inhibitor (Invitrogen公司)，Taq DNA polymerase(Promega公司)，野百合堿(MCT，Sigma Chemical公司)。OPN和整合素β3鼠抗人單克隆抗體(工作液)，羊抗鼠生物素化IgG(工作液)。

1.3建立肺動(dòng)脈高壓和右心室重塑動(dòng)物模型 每組大鼠在注射MCT后第1、2、3、4周獲取組織。這四個(gè)試驗(yàn)組分別簡(jiǎn)稱(chēng)PAH1、PAH2、PAH3和PAH4實(shí)驗(yàn)組。飼養(yǎng)1 w后皮下注射MCT (60 mg/kg)，注射后第1、2、3、4周測(cè)量血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)并留取標(biāo)本,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)10只大鼠〔3〕。對(duì)照組注射生理鹽水后4 w重復(fù)測(cè)壓。以放血的方式處死動(dòng)物，迅速取出其心肺(置于液氮內(nèi)待測(cè))后剪下右心室，分別稱(chēng)取右心室(RV)，左心室加室間隔(LV+S)的重量，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)=〔Rv(LV+S)〕。

1.4RT-PCR法測(cè)定OPN和整合素β3 mRNA表達(dá) 根據(jù)Trizol一步法從凍存右心室中提取總RNA后采用20 μl反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以O(shè)PN mRNA、整合素β3 mRNA和β-actin mRNA為模板設(shè)計(jì)引物后分別進(jìn)行OPN、整合素β3與β-actin擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物后用凝膠成像儀觀察，半定量分析條帶峰面積(Image Master Total lab v1.01)，分別計(jì)算OPN、整合素β3與β-actin光密度的比值。見(jiàn)表1。

1.5免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定OPN和整合素β3蛋白的表達(dá) 采用SP法，石蠟切片(3～5 mm)，常規(guī)脫水后微波加熱修復(fù)12 min后加一抗于4℃過(guò)夜，復(fù)溫后，加二抗，室溫孵育25 min，加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育25 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5～20 min，蘇木素復(fù)染后顯微鏡觀察并照相。陽(yáng)性對(duì)照切片由我院病理科提供，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。OPN和整合素β3表達(dá)在細(xì)胞胞質(zhì)中，呈棕黃色的顆粒。采用IBAS 2.5全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，每張切片在400倍光鏡下分別取5個(gè)視野測(cè)定灰度值，求平均值。

1.6Western 印跡法檢測(cè)OPN和整合素β3蛋白表達(dá)的水平 心肌組織常規(guī)蛋白電泳和膜轉(zhuǎn)入。一次抗體反應(yīng)(1∶200，4℃，12 h)后進(jìn)行二次抗體反應(yīng)(1∶1，1 h)，與過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈球菌抗生物素蛋白(1∶1) 反應(yīng)1 h后用增強(qiáng)的蛋白反應(yīng)系統(tǒng)探測(cè)免疫反應(yīng)帶，將反應(yīng)帶膠片置于ES2000掃描儀中掃描并將圖像經(jīng)Power Mac Photoshop6.0軟件轉(zhuǎn)送至NIH-Image 1.62軟件中對(duì)反應(yīng)帶的面積和密度進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件。多組計(jì)量資料的比較采用方差分析，兩兩比較方差齊性者采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnettt3法；采用Pearson等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組OPN和整合素β3 mRNA及蛋白水平 對(duì)照組大鼠右心室心肌OPN及其整合素β3 mRNA表達(dá)水平低于肺動(dòng)脈高壓各組(P<0.05)，且隨著肺動(dòng)脈高壓時(shí)間延長(zhǎng)，兩者表達(dá)水平均呈升高趨勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。OPN和整合素β3主要表達(dá)于心肌細(xì)胞質(zhì)中，在光鏡下呈棕黃色染色。對(duì)照組心肌OPN和整合素β3受體表達(dá)水平均很低。肺高壓組心室心肌OPN和整合素β3受體表達(dá)水平增高，并隨著肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)生的時(shí)間延長(zhǎng)而增高(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.2右心室肥厚指數(shù)與OPN和整合素β3 mRNA的表達(dá)的相關(guān)性分析 右心室心肌0PN mRNA及整合素β3 mRNA表達(dá)水平與右心室肥厚指數(shù)均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.828、0.822(P<0.05)。

2.3Westem 印跡檢測(cè)各組OPN和整合素β3檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 在實(shí)驗(yàn)第4周，PHA4組大鼠右心室心肌組織OPN和整合素β3蛋白表達(dá)水平(分別為16.67±1.73 和14.28±1.22)均高于對(duì)照組(分別為4.42±0.72和3.93±0.70)，P<0.01。見(jiàn)圖3。

表1 大鼠OPN，整合素 β3及β-actin引物

表2 各組大鼠OPN與整合素β3 mRNA表達(dá)變化

C，1，2，3，4分別為對(duì)照組，PHA1，PHA2，PHA3和PHA4組

對(duì)照組，OPN PHA4組，OPN 對(duì)照組，整合素β3 PHA4組，整合素β3

圖3 OPN和整合素β3蛋白免疫印跡圖

3 討 論

肺動(dòng)脈高壓是肺心病患者的常見(jiàn)病理特征，發(fā)展末期常導(dǎo)致心肌損傷從而形成右心室肥大。肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，有多種因素參與此病理過(guò)程〔4～12〕。有學(xué)者認(rèn)為心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及肥大的過(guò)程與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和整合素有關(guān)〔13〕。OPN是一種含有能與心肌細(xì)胞表面整合素β3結(jié)合的RGD結(jié)構(gòu)的非膠原性細(xì)胞外基質(zhì)，與血管平滑肌及心肌細(xì)胞的遷移、增殖和分化等過(guò)程有密切關(guān)系〔13〕。Chen等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)OPN是血管平滑肌細(xì)胞由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記，抑制血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，在抗炎和損傷修復(fù)過(guò)程中的重要作用。整合素β3基因通過(guò)識(shí)別并結(jié)合RGD結(jié)構(gòu)從而參與細(xì)胞活動(dòng)，生長(zhǎng)因子等能夠提高鼠心肌間質(zhì)纖維細(xì)胞ανβ3 mRNA水平，并激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)脆生長(zhǎng)，可能與心肌重建有關(guān)〔10,11〕。

本次研究結(jié)果提示肺動(dòng)脈高壓情況下右室心肌中OPN及其整合素β3受體mRNA表達(dá)增加，可能與肺動(dòng)脈高壓下右室肥大的發(fā)生機(jī)制有關(guān)；并且證實(shí)OPN和整合素β3受體蛋白表達(dá)和右心肥大的產(chǎn)生有密切關(guān)系。推測(cè)OPN及其整合素β3受體高表達(dá)與肺動(dòng)脈高壓時(shí)右心室肥大有關(guān)。作用機(jī)制可能是肺動(dòng)脈高壓下右心室壓力增加導(dǎo)致OPN增加，OPN增加導(dǎo)致整合素β3受體與其結(jié)合增加從而激活細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激細(xì)胞增長(zhǎng)加快從而重建右心室。

綜上，右心室心肌OPN及其受體整合素β3基因表達(dá)隨著大鼠肺動(dòng)脈高壓及右室肥大形成逐漸增加，可能在右心室心肌重塑中起重要的作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Li G,Chen YF,Kelpke SS,etal.Estrogen attenuates integrinbeta(3)-de-pendent adventitial fibroblast migration after inhibition of osteopontin production in vascular smooth muscle cells〔J〕.Circulation,2000;101(25):2949-55.

2Trueblood NA,Xie Z,Communal C,etal.Exaggerated left ventricular dilation and reduced collagen deposition after myocardial infarction in mice lacking osteopontin〔J〕.Circ Res,2001;88(10):1080-7.

3Okada K,Tanaka Y,Bernstein M,etal.Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury:a neointimal model of pulmonary hypertension〔J〕.Am J Patbol,1997;151(4):1019-25.

4Chen YF,Feng JA,Li P,etal.Atrial natriuretic peptide - dependent modulation of hypoxia - induced pulmonary vascular remodeling〔J〕.Life Sci,2006;79(14):1357-65.

5Renault MA,Jalvy S,Belloc I,etal.AP - 1 is involved in UTP - induced osteopontin expression in arterial smooth muscle cells〔J〕.Circ Res,2003;93(7):674-81.

6Liou YM,Chang LY,Liaw JM,etal.Osteopontin gene expression in the aorta and the heart of propylthiouraeil - induced hypothyroid mice〔J〕.J Biomed Sci,2005;12(6):869-80.

7Weintraub AS,Lin X,Itskovich VV,etal.Prenatal detection of embryo resorption in osteopontin - deficient mice using serial noninvasive magnetic resonance microscopy〔J〕.Pediatr Res,2004;55(3):419-24.

8Tamura A,Shingai M,Aso N,etal.Osteopontin is released from the heart into the coronary circulation in patients with a previous anterior wall myocardial infarction〔J〕.Circ J,2003;67(9):742-4.

9Hsueh WA,Law RE,Do YS.Integrins,adhesion,and cardiac remodeling〔J〕.Hypertension,1998;31(1 Pt 2):176-80.

10武宗寅,喻林升.低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓大鼠血漿內(nèi)皮素和肺細(xì)小動(dòng)脈顯微形態(tài)的變化〔J〕.中國(guó)病理生理雜志,1997;13(4):383-5.

11Gravallese EM.Osteopontin:a bridge between bone and the immune system〔J〕.J Clin Invest,2003;112(2):147-9.

12Xie Z,Singh M,Singh K.Osteopontin modulates myocardial hypertrophy in response to chronic pressure overloas in mice〔J〕.Hypertension,2004;44(6):826-31.

13Swynghedauw B.Molecular mechanisms of myocardial remodeling〔J〕.Physiol Rev,1999;79(1):215-62.