YAP干擾質粒的構建及轉染肺腺癌細胞A549的篩選鑒定

韓高揚 趙 松 黨麗峰 齊 宇 楊 洋 劉東雷 張春敭 吳 愷

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科，河南 鄭州 450052)

Hippo信號轉導通路是高度保守的負反饋調節通路，YAP基因作為人Hippo通路的主要效應因子，可以引起下游轉錄因子cyclinE和DIAP1等表達增加，促進增殖及抑制凋亡作用，從而完成對器官大小、組織再生和干細胞自我更新方面的控制〔1～3〕。近年來，Hippo通路與腫瘤間的聯系引起了人們的重視，多項研究證實了YAP在多種腫瘤中的表達明顯上調〔4〕。本研究設計和構建了針對靶向YAP基因的小發卡RNA(shRNA)，建立穩定轉染并低表達YAP基因的肺癌A549細胞系，為以后特異性了解Hippo信號傳導通路及YAP基因在肺癌細胞惡性增殖及侵襲能力中所發揮的作用，并進一步探討其作用機制提供依據，以期為肺癌的綜合治療及Hippo信號通路的調節提供新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1材料 人肺癌細胞A549由河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室凍存。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含EDTA胰蛋白酶消化液購自Solarbio公司，載體質粒和大腸桿菌購自吉碼生物公司。各種限制性內切酶、DNA連接酶及熒光定量PCR引物和內參引物均購自生工生物有限公司。TRIZOL、逆轉錄試劑盒均購自鼎國生物有限公司。熒光試劑盒購自BMI生物公司。抗YAP抗體購自Santa Cruz，二抗購自博奧森生物公司。脂質體購自吉凱基因生物有限公司。

1.2靶向YAP干擾質粒的設計和構建 根據GenBank中人YAP基因的cDNA序列，利用Invitrogen網站提供的軟件合成YAP基因的特異性干擾片段，針對靶基因不同的靶點設計4個shRNA，分別為shRNA1～4，同時在上游引物5′端增加Xho I的酶切位點，下游引物5′端增加BamH I的酶切位點。shRNA1正義鏈：5-GCCATGACTCAGGATG-GAGAATT-3，反義鏈：5-ATTCTCCATCCTGAGTCATGGC-3；shRNA2正義鏈：5-CCCAGTTAAATGTTCACCAATT-3，反義鏈：5-AATTGGTGAACATTTAACT-GGG-3；shRNA3正義鏈：5-GCCACCAAGCTAGATAAAGAAT-3，反義鏈：5A-TTCTTTATCTAGCTTG-GTGGC-3；shRNA4正義鏈為5-CAGGTGATACTATCAA-CCAAAT-3，反義鏈：5-ATTTGGTTGATAGTATCACCTG-3；陰性對照表達載體NCRNA正義鏈為5-TTCTCCGAACGT-GTCACGTT-3，反義鏈：5-AACGTGACACGTTCGGAGAA-3。序列合成后的寡核苷酸雙鏈(ds oligo)，用T4DNA連接酶將雙鏈寡核苷酸與pGPU6-GFP-Neo線性載體定向連接后轉化大腸桿菌TOP10，含新霉素的LB瓊脂平板篩選，次日挑取平板上陽性單克隆菌并擴增培養，進行測序分析。根據測序結果挑取陽性單克隆菌，接入培養基中，搖床24 h，用質粒提取試劑盒提取經擴增篩選正確的重組質粒，取構建的質粒再次行PCR擴增測序。

1.3shRNA轉染細胞 人肺癌細胞A549培養于含10%胎牛血清的1640中，轉染前24 h，用胰蛋白酶消化腫瘤細胞，接種于6孔板中(每孔約1.5×105個細胞)，轉染前6 h換無血清無抗生素的培養基，37℃，5%CO2環境中培養，在生長到40%～70%時進行轉染。溶液A：1.2 μg shRNA溶于含250 μl無血清的培養基中，溶液B：4.5 μl脂質體溶于250 μl無血清培養基中，室溫下孵育5 min。將A，B溶液混合，室溫下靜置20 min后，混合A、B兩溶液后加入1.5 ml無血清培養基，將混合后的溶液加入到漂洗過的細胞上，37℃，5%CO2環境中培養6 h，換成含血清含抗生素的培養基繼續培養。24 h觀察熒光，確定轉染效率，48 h后提取mRNA和總蛋白。

1.4RT-PCR檢測 采用TRIzol法分別抽提6種細胞的總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。進一步利用RT-PCR檢測YAP基因低表達程度。YAP引物序列：正義GCTCTTCCTTGTCCATTGCT，反義CATCATCCAAACAGGCTC-AC；以管家基因β-actin作為內參，引物序列：正義AGCGAGCATCCC-CCAAAGTT，反義GGGCACGAAGGCTCATCATT。反應體系：cDNA 2 μl，上游引物、下游引物各1 μl，SYBR solution混合物12.5 μl，加ddH2O至25 μl。反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個循環；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s。每組設3個復孔，以β-actin作為參照，計算Ct均值，應用相對定量法ΔΔCt進行定量分析。

1.5Western印跡檢測 48 h后提取腫瘤細胞中的蛋白，采用紫外分光光度計測蛋白濃度，配置分離膠，水封，加濃縮膠，第一孔加Marker，第二孔加用shRNA1轉染腫瘤細胞的蛋白，第三孔加用shRNA2轉染腫瘤細胞的蛋白，第四孔加用shRNA3轉染腫瘤細胞的蛋白，第五孔加用shRNA4轉染腫瘤細胞的蛋白，第六孔加NCshRNA轉染的腫瘤細胞蛋白，第七孔加未進行轉染的腫瘤細胞的蛋白，跑膠，電泳轉膜，封閉，加一抗(1∶200)4℃過夜孵育，TBST洗膜三遍，加稀釋的二抗(1∶2 000)孵育，TBST洗滌三遍，加熒光顯影劑(注意避光，掃描圖片)。

2 結 果

2.1轉染效率的觀察 細胞轉染后48 h，在倒置熒光顯微鏡下，shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，NCRNA組均可觀察到熒光(圖1)，提示構建的干擾載體均可有效表達。

圖1 A549細胞質粒轉染48 h后轉染效率

2.2RT-PCR結果 shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4組相對于空白對照組，YAP mRNA表達均有所下調，其中shRNA2組和shRAN3組表達下調最明顯，shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，NCRNA組和空白對照組2-ΔΔct值分別為2.775，0.498，0.432，2.834，3.289，3.320。shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4組相對與空白對照組分別下降了17%，85%，87%，12%。shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4組與NCRNA組和空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，NCRNA組與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3Western印跡結果 shRNA1組，shRNA2組，shRNA3組，shRNA4，NCRNA組，空白對照組的蛋白相對灰度值分別為0.690，0.411，0.354，0.688，0.699，0.712，shRNA3組表達蛋白最低，其中shRNA2組和shRNA3組與shRNA1組、shRNA4組、shRNA5組和空白對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，shRNA1組、shRNA4組、shRNA5組和空白對照組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

shRNA1 shRNA2 shRNA3 shRNA4 NCRNA 空白對照組

3 討 論

在Hippo通路中，Hpo、Sav、Wts、Mats都是抑癌基因，只有Yki是癌基因；同樣，在人體中，Hippo通路也是細胞增殖的負調控通路，而YAP是磷酸化后抑制的關鍵轉錄激活因子。近來有研究證明YAP是一個癌基因，作為Hippo通路的下游信號分子，YAP具有促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，導致細胞接觸性抑制喪失及促進細胞惡性分化的作用。已經有研究結果支持這一觀點，如YAP mRNA及YAP蛋白在肝癌、胰腺癌及結腸癌組織中表達明顯上調〔5〕。但是，YAP作為促癌因子促進腫瘤發生的同時，在某些情況下還具有促進凋亡的作用。在DNA損傷時，PML募集YAP及p73蛋白到核內作為轉錄輔助激活因子，YAP增強p73相關凋亡基因的轉錄〔6〕。此外，有人在乳腺癌的研究中發現，YAP在乳腺癌中的表達明顯下調甚至缺失，而且YAP缺失的乳腺癌細胞表現出了更強的浸潤及轉移能力〔7〕。因此，有研究者認為YAP作為癌基因的角色需要重新定位。

肺癌是世界上死亡率最高的癌癥，每年約120萬人死于肺癌。盡管在手術和放化療方面取得了長足的進步，但是肺癌的5年生存率仍然小于15%。在確診的肺癌患者中，超過80%的病人是非小細胞肺癌，包括鱗癌、腺癌、大細胞癌等〔8，9〕。因此，本研究選取肺癌細胞作為研究的載體。

就目前國內外研究所見，鮮有Hippo通路及YAP基因在肺癌細胞中表達及作用的報道。本研究擬分析YAP基因在肺癌細胞中的表達水平，針對YAP基因設計靶向性的shRNA，特異性的干擾YAP基因的表達，為進一步特異性的了解Hippo信號傳導通路在細胞惡性增殖及侵襲能力中的作用以及其在非小細胞肺癌發生發展過程中所具有的作用及機制做鋪墊；并為進一步探索其調控機制奠定基礎，為非小細胞肺癌提供新的治療靶點。

4 參考文獻

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4Zhao ，Li L，Lei Q，etal.The Hippo-YAP pathway in organ size control and tumorigenesis: an updated version〔J〕.Genes Dev,2010;24(9):862-74.

5Steinhardt AA，Gayyed MF，Klein AP，etal.Expression of Yes-associated protein in common solid tumors〔J〕.Hum Pathol，2008;39(11):1582-9.

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7Yuan M，Tomlinson V，Lara R，etal.Yes-associated protein(YAP) functions as a tumor suppressor in breast〔J〕.Cell Death Differ，2008;15(11):1752-9.

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