懷化侗族高血壓人群IL-1Ra、CK-18、α-烯醇化酶蛋白質表達差異

金 玲 幸 梓 劉衛武 何小進 段于峰 曹湘玉

(懷化醫學高等專科學校，湖南 懷化 418000)

中國高血壓患者腦卒中的發生率要遠遠高于歐美國家，本研究采用蛋白質組學的技術，分析懷化侗族高血壓、漢族高血壓及侗族正常人血淋巴細胞表達的差異，以進一步揭示高血壓的免疫和炎癥特性。

1 材料與方法

1.1研究對象 2011年9～10月在懷化醫學高等專科學校附屬懷化市第三人民醫院心血管內科高血壓住院患者40例(繼發高血壓除外)，漢族，組成漢族高血壓組。其中男20例，女20例，年齡45～81〔平均(57.49±7.71)〕歲；懷化通道侗族自治縣隴城鄉自然村落中隨機選取侗族高血壓患者50例作為侗族高血壓高發組，年齡40～73〔平均(54.64±6.23)〕歲；再在該村落隨機選取40例正常人作為侗族正常組，年齡40～71〔平均(51.41±5.62)〕歲。

1.2高血壓診斷標準 采用《1999年WHO/ISH高血壓指南》制訂的高血壓診斷標準，在未使用抗高血壓藥物的情況下，收縮壓(SBP)≥ 140 mmHg和(或)舒張壓(DSP) ≥ 90 mmHg即確定為高血壓；既往有高血壓史，目前正在使用抗高血壓藥物，現血壓雖未達到上述水平，亦診斷為高血壓。

1.3主要試劑和儀器 主要試劑：丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、SDS、Tris、甘氨酸、Triton X-100、碳酸氫胺、乙腈、甲酸購自USB公司；二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、固相pH梯度干膠條、IPG緩沖液、兩性電解質、胰蛋白酶、考馬斯亮藍G-250均購自Amersham bioscience公司。主要儀器：IPGphor等電聚焦儀(Amersham Bioseiences公司)；Ettan DALT垂直電泳槽(Amersham Biosciences公司)；SDS.PAGE電泳儀(Bio-Rad公司)；Imagescanner掃描儀(Amersham Bioscienees公司)；低溫高速離心機(Beckman公司)；Voyager MALDI-TOF質譜儀(ABI公司)。

1.4方法

1.4.1樣品制備和蛋白濃度測定 將采集的新鮮血(肝素抗凝20 U/ml)2 ml加Hank液2 ml，混勻。小心將稀釋后的血液緩慢的沿管壁加入預先加有2 ml淋巴細胞分離液的10 ml玻璃試管中，使加入的血液留在分離液的上面。以1 500 r/min離心(半徑15 cm水平轉子)15 min，小心取出，吸取淋巴細胞層(順次為血漿-淋巴細胞層-分離液-紅細胞)，于另一試管中，加入4倍左右的Hank液，混勻，以2 000 r/min離心10 min。吸掉上層液體，將沉淀用Hank液反復洗兩次，最后用PBS液洗一次，2 000 r/min離心10 min將細胞離心到管底，將所得細胞按1∶4比例加細胞裂解液裂解，4℃放置1 h，24 000 r/min,離心60 min，取上清得所需蛋白質，再用蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白質濃度。

1.4.2二維凝膠電泳

1.4.2.1第一向固相pH梯度等電聚焦(IEF) 操作步驟主要依據IPGphor等電聚焦系統使用指南進行〔1〕。首先將血淋巴細胞總蛋白質與水化液充分混合，使上樣總體積控制在350 μl(含總蛋白質1 000 μg)。然后將混合液均勻地加入IPG膠條槽，再取出IPG干膠條，揭去保護膜，把膠面朝下置入膠條槽并與膠條槽的電極緊密接觸，以避免出現氣泡。覆蓋一層Immobiline Drystrip覆蓋液后蓋上膠條槽的蓋子，放置于IPGphor等電聚焦儀上，確定膠條槽的電極與聚焦儀面板接觸正確后，關上安全蓋。設置程序，使水化和聚焦均在20℃下進行，總電壓時間設為80 000 Vh，其中于30 V低電壓水化14 h，然后經過500 V 1 h、1 000 V 1 h，5 000 V 1 h，最后穩定在8 000 V下進行等電聚焦8.5 h。

1.4.2.2平衡 等電聚焦后立即取出IPG膠條，先后置于10 ml平衡A液和10 ml平衡B液中，在搖床上搖振，再各平衡15 min。

1.4.2.3第二向垂直SDS-PAGE電泳 將平衡后的膠條移至濃度為12.5%、厚0.75 mm的PAGE分離膠上端，排凈氣泡后，以0.5%的瓊脂糖封膠。電泳條件為：2.5 W/膠電泳30 min，然后以11 W/膠恒功率電泳，直至溴酚藍指示線達到凝膠底邊處，停止電泳。

1.4.3考馬斯亮藍G-250染色 從玻璃板上將凝膠剝離下來后放置于干凈的染色盤中，在每塊凝膠中加入250 ml考馬斯亮藍G-250進行染色，搖床上緩慢搖動。染色后傾倒染色液用含20%乙醇的脫色液進行脫色，直至背景清晰。

1.4.4凝膠圖像分析 凝膠經Imagescanner掃描儀掃描，獲取分辨率為300DPI圖像(圖像和凝膠大小比例為1∶1)，再用Image Master圖像分析軟件先后進行點檢測、背景消減、標準化、匹配、建立平均凝膠、差異比較等分析。

1.4.5質譜分析

1.4.5.1質譜樣品制備 將移液器的吸頭尖端用剪刀剪掉，使其孔直徑與欲取蛋白質點的大小一致，用修剪后的吸頭從凝膠上切取差異蛋白質點，放置于1.5 ml Eppendorf管中；用雙蒸水振動洗滌3次；每點加脫色工作液(200 mmol/L NH4HCO3∶100% ACN=1∶1)50 μl，在37℃恒溫水浴箱中水浴30 min，等凝膠藍色消退后，棄去脫色工作液，再用超純水反復沖洗至無色；每點加入100% ACN 100 μl，脫水2次； 把膠塊用冷凍干燥儀抽干10 min至完全脫水；每點加酶解工作液(40 mmol/L NH4HCO3溶解的O.04 μg/μl TPCK-Trypsin酶液)5 μl同時在冰上吸脹60 min；每點加酶解緩沖液30 μl(200 mmol/L NH4HCO3200 μl+100%ACN 90 μl+雙蒸水710 μl)，在37℃恒溫水浴箱中酶解24 h或過夜；將上清液收集于0.5 ml Eppendorf管中；每膠點加萃取工作液(100%ACN∶5%甲酸=1∶1)30 μl，37℃恒溫水浴箱中水浴60 min；在冷凍干燥儀中完全濃縮至凍干，備用。

1.4.5.2MALDI-TOF-MS質譜分析 將點樣板制備好，用Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS質譜儀進行分析，進行反射模式，正離子譜測定，采用20 000 V的離子源加速電壓，反射電壓比使用1.12，N2激光波長為337 nm，脈沖寬度3 ns，離子延遲抽提100 ns，真空度4×10-7Torr，質譜信號單次掃描累加50次，外部標準采用ACTH，內部標準校正使用胰蛋白質酶自切降解峰(842.510，2 211.105)，獲得肽質量指紋圖(PMF)。

1.4.5.3數據庫查詢 采用MatrixScience公司的Mascot Distiller或Mascot Wizard軟件進行MALDI-TOF-MS質譜圖解譜，在計算機上仍需安裝ABI公司的Data ExploreTM軟件以便Mascot Distiller或Mascot Wizard調用Data ExploreTM軟件來處理ABI公司MALDI-TOF-MS質譜產生的原始文件進行解譜。Mascot Distiller或Mascot Wizard軟件均使用其默認參數設置。采用MatrixScience公司的Mascot進行數據庫查詢，查詢網址為http：//www.matrixscience.com/cgi/search-form.pl? FORMVER=2&SEARCH=PMF。數據庫檢索參數為：Your name和E-Mail內輸入相應的名字和E-Mail地址，數據庫選用NCBInr數據庫，物種分類(Taxonomy)選用人類(Homo sapiens)，酶選用Trypsin，選擇1為允許的未酶切位點，固定修飾(Fixed modifications)選用碘乙酰胺Carbamidomethyl(C)修飾，可變修飾不選，選用100 ppm為肽片段容差，Mass values選擇MH+，選擇Monoisotopic，選用直接輸入Mascot Distiller或Mascot Wizard產生的臨時文件或單同位素峰的列表(Peak Lists)即能進行數據庫檢索。

1.5統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.12-DE圖譜的重復性和分辨率 為了保證結果的可靠性，在相同條件下分別對侗族高血壓、侗族正常人、漢族高血壓三組血淋巴細胞總蛋白質樣品各進行了三次重復雙向凝膠電泳分離，凝膠顯色后得到背景清晰、匹配性好、分辨率高的2-DE圖譜(上樣量為1 000 μg)，蛋白質點的重復性好，證明樣品制備穩定,能夠用于差異蛋白表達研究的分析。

2.2淋巴細胞蛋白表達的比較 以侗族正常人血淋巴細胞蛋白二維電泳圖譜為基準，侗族高血壓圖譜點440表達上調，點391表達差異無統計學意義(P﹥0.05)，點527表達下調；漢族高血壓圖譜391、440兩個點表達上調，點527表達下調。見表1，圖1。

2.3質譜鑒定結果 用MALDI-TOF-MS質譜分析對3組的上述3個差異蛋白點進行質譜分析，質譜圖見圖2，質譜鑒定結果，見表2。

圖1 淋巴細胞蛋白二維電泳圖譜

表1 三組蛋白點差異比較

表2 差異蛋白質鑒定結果

A：391號蛋白質點的PMF圖；B：440號蛋白質點的PMF圖；C：527號蛋白質點的PMF圖

3 討 論

最近的研究結果表明：免疫系統中的淋巴細胞特別是T淋巴細胞激活參與了高血壓的病理生理及炎癥過程〔2〕；Guzik等〔3〕也通過重組激活基因敲除小鼠模型研究發現，T細胞參與血壓升高及血管損傷。因此探討免疫細胞參與血壓升高的機制具有重要的現實和臨床意義。本研究采用二維凝膠電泳聯合質譜技術(2-DE/MS)，初步獲得重復性好的血淋巴細胞蛋白質雙向凝膠電泳圖譜，運用MALDI-TOF-MS成功鑒定了20個蛋白點的信息，并對其中IL-1、細胞角蛋白18、α-烯醇化酶3個差異表達蛋白點進行分析。

IL-1家族包括IL-1α、IL-1β和IL-1Ra，是炎癥反應的重要標志物，由多種細胞如單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、內皮細胞和間質細胞等產生，起介導炎癥反應的作用。國內外學者研究發現：IL-1活性在很大程度上取決于IL-1Ra對其的調控〔4〕；IL-1Ra在感染、膿毒血癥、創傷、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎等急慢性炎癥及免疫疾病中升高〔5，6〕；IL-1Ra也可能在糖尿病微血管病變中發揮重要的效應〔7〕。本實驗中，侗族高血壓和漢族高血壓人群IL-1Ra的表達與侗族正常人比較均出現下調，這一結果提示，IL-1Ra的表達可能與高血壓存在相關性，與Lin等〔8〕研究英國凱爾特白人群體高血壓，發現IL-1Ra多態性與高血壓病存在相關性的結果一致；但與李艷等〔9〕研究我國湖北省漢族人群高血壓發現IL-1Ra多態性與高血壓病之間不存在相關性這一報道不一致，這可能與不同地域、不同種族高血壓人群的發病特點有關，針對該結果，我們將把IL-1Ra作為高血壓診斷的可能候選生物標記物進行進一步的重點研究。

CK-18，KRT18屬于細胞骨架中間絲蛋白中的角蛋白家族成員，是肝細胞相對特異性標志,主要分布于所有的正常上皮細胞及上皮性癌細胞中。以往的研究發現：該蛋白在腫瘤細胞中表達豐富；而有限的臨床流行病學研究資料也提示該蛋白與乳腺癌的預后密切相關〔10〕。本實驗中漢族高血壓人群CK-18的表達與侗族正常人比較出現上調，而侗族高血壓人群CK-18的表達與侗族正常人比較差異無統計學意義，具體機制不明，有待于進一步研究。

神經元特異性烯醇化酶(NSE)是一個較為敏感的特異性反映神經元損傷的量化指標〔11〕，NSE的定量測定可作為判斷高血壓腦出血急性期病情輕重及評價發生意外的客觀指標〔12〕,大量的研究已證實：NSE與高血壓病情發展、惡化密切相關〔11～14〕，但α-烯醇化酶與高血壓的關系，目前尚未發現相關報道。在本實驗中，通過蛋白質組學研究發現無論是侗族高血壓還是漢族高血壓均可見α-烯醇化酶表達上調，這提示α-烯醇化酶可能是一種潛在的高血壓誘導劑，可作為預測高血壓發生、發展程度的一個候選生物學標志物。

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