重組腺相關病毒介導神經肽Y基因轉染對紅藻氨酸致癇大鼠海馬P35表達的影響

張新穎 婁 燕 李文玲 董長征 趙文清

(河北省人民醫院兒科，河北 石家莊 050051)

神經肽Y(NPY)及其受體與癲癇的發生密切相關〔1〕，Woldbye等〔2〕研究顯示腦室內注射NPY能抑制運動性癲癇發作，并能大幅度減少在齒狀回和CA3區記錄到的由紅藻氨酸(KA)誘發的癲癇腦電，起到一定程度的抗驚厥作用。P35是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5(Cdk5)激活劑，Cdk5持續激活可誘發海馬苔蘚纖維出芽(MFS)和突觸重建，從而促進癲癇的反復發作〔3，4〕。董長征等〔5，6〕前期實驗已應用免疫熒光染色方法證明rAAV2/1-hNPY-EGFP在癲癇病理狀態下的腦組織中可以實現有效表達，且腦室注射途徑優于海馬注射途徑，本實驗采用多次KA海馬內注射制成大鼠慢性癲癇模型〔7〕，并通過腦室注射攜帶人源性神經肽Y(hNPY)基因的腺相關病毒載體，運用熒光定量PCR及免疫組織化學技術檢測癲癇大鼠海馬組織中NPY及P35 mRNA和蛋白水平。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 清潔級健康雄性老年Wistar大鼠96只，體重250～270 g〔由河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證：SCXK(冀) 2008-1-003，合格證編號：1103040〕，于河北省人民醫院臨研中心動物室分籠喂養，20℃～26℃環境溫度，自由進食水。采用隨機數字法分為A、B、C、D 四組，每組24只。

1.2主要實驗試劑和設備 介導人源性神經肽Y治療基因和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的rAAV2/1-hNPY-EGFP載體由北京本元正陽基因技術有限公司提供，有效滴度為5×1011/ml；(KA批號079k1737) 購自美國Sigma公司；立體定向儀購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；兔抗NPY多克隆抗體購自北京博奧森公司；兔抗P35多克隆抗體購自美國Bioword公司； Trizol試劑、PCR擴增試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；熒光定量PCR逆轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3慢性癲癇模型的建立 根據參考文獻〔5〕方法建立慢性癲癇模型。先用10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，然后將其固定于立體定向儀上，剪除術區毛發，75%的酒精消毒處理后沿大鼠頭頂部正中線縱行切開頭皮，切口長約3 cm，用頭皮拉鉤將頭皮向兩側對稱地拉開并固定, 根據George Painos大鼠腦立體定位圖譜，確定大鼠右側海馬CA3區中心點的三維坐標: X=-5.3 mm,Y=4.0 mm, Z=-6.0 mm, 即為海馬區注藥點。用電鉆在顱骨上鉆孔，微量進樣器抽取KA 2 μl (濃度0.4 μg/μl) 于20 min內勻速注射至大鼠海馬的CA3區, 留置5 min后，緩慢退出微量進樣器。此后，每間隔2 d重復注射1次，劑量同前，共注射KA 5次，D組注射同等容量的生理鹽水。依據Racine分級標準，至少連續出現3次Ⅳ級或以上的驚厥發作被認為完全點燃。造模成功的大鼠隨機分為A組、B組和C組。A組不做任何處理，B組和C組接著進行基因轉染手術。

1.4基因重組體注射 造模成功后1周再次將大鼠麻醉，確定大鼠側腦室注射靶點的三維坐標:X=-1.0 mm，Y=1.5 mm，Z=-3.8 mm, 在立體定向儀輔助下，B組用微量進樣器向靶點注射rAAV2/1-empty-EGFP，注射量10 μl，滴度為5×1011/ml，注射時間20 min，注射速度0.5 μl/min, 注射完畢后用少量無菌骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。C組用同樣的方法注射等量的rAAV2/1- hNPY-EGFP。

1.5大鼠海馬NPY及P35的免疫組化染色及圖像分析 在基因導入后2 w和4 w，隨機選取不同實驗組和對照組大鼠各12只，每個時間點6只，腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg)麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取含有海馬的中段腦組織，石蠟包埋，冠狀位連續切片，片厚5 μm，每隔5張取1張，以鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶S-P免疫組化染色法行NPY及P35的免疫組化染色。免疫組化結果判定方法：對染色反應陽性強度進行半定量分析。染色強度以多數細胞為準，染色呈淺棕黃色為弱陽性，呈深黃色為陽性，呈深棕褐色為強陽性。陽性細胞數的計量方法為，觀察10個固定高倍視野，每個高倍視野計數100個細胞中陽性細胞的數目，最后取其均值。陽性細胞數量<10%為陰性；10%～50%為弱陽性； 50%～80%為陽性；80%～100%為強陽性。

1.6大鼠海馬NPY及P35的熒光定量PCR檢測 在基因導入后2 w和4 w，隨機選取不同實驗組和對照組大鼠各12只，每個時間點6只，迅速分離海馬，Trizol提取海馬總RNA，測定其濃度及純度。每個樣品取2 μl RNA反轉錄合成cDNA，再各取1 μl cDNA進行PCR擴增。引物序列: NPY上游: 5′-TCGTGTGTTTGGGCATTCTG-3′,下游5′-TCAGTGTCTCAGGGCTGGAT-3′,擴增長度164 bp。P35上游: 5′-ACACTGTTTGAGGATGGCG-3′,下游: 5′-TGGCGTTCTTGCTGTTCT-3′,擴增長度為67 bp。為了準確檢測表達水平，選用大鼠GAPDH cDNA序列作為內參照。GAPDH上游: 5′- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′;下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTG-3′;擴增長度為452 bp。引物由上海生物工程有限公司采用美國PE公司391型DNA自動合成儀合成。PCR條件為: 96℃預變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行40個循環，在每個循環的第三步72℃ 30 s收集熒光信號。擴增完畢后，進入結果分析界面，以GAPDH為內參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)用于統計學分析。

1.7統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件進行Kruskal-WallisH檢驗。

2 結 果

2.1大鼠海馬NPY及P35的免疫組織化學結果 海馬各區NPY均有表達，其陽性神經元胞體呈圓形或橢圓形，著色部位為胞質，顏色呈棕褐色，并可見NPY陽性纖維的表達。基因轉染后2 w和4 w，與D組相比，A組、B組和C組大鼠海馬CA3區NPY陽性神經元表達均增多，著色加深。與A組及B組相比，C組在2 w時NPY陽性神經元表達無明顯差異，但在4 w時其表達量明顯高于A組和B組，著色加深。見圖1，表1。

圖1 大鼠海馬CA3區NPY表達(DAB,×400)

P35陽性神經元在各組大鼠海馬中均有表達，呈現胞體圓形或橢圓形，著色部位為胞核，顏色呈棕褐色，海馬各區均有分布，主要位于大鼠海馬CA3區和CA1區錐體細胞、齒狀回顆粒細胞以及門區神經元胞體和突起內。在基因轉染后2 w和4 w，與D組相比，A組、B組和C組大鼠海馬CA3區P35陽性神經元表達均增多，著色加深。與A組及B組相比，C組在2 w時海馬組織中P35陽性神經元表達無明顯差異，但在4 w時海馬組織中表達量明顯低于A組和B組，著色變淡。見圖2，表1。

2.2大鼠海馬NPY及P35 mRNA的表達 在基因轉染后2 w和4 w，與D組相比，A組、B組和C組NPY、P35 mRNA表達均高于對照組(P<0.05)。與A組及B組相比，C組在2 w時海馬組織中NPY、P35 mRNA表達無明顯差異(P<0.05)，但在4 w時NPY mRNA表達量明顯高于A組和B組(P<0.05)，見表2。而P35 mRNA表達量明顯低于A組和B組(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠海馬CA3區NPY表達免疫組化結果

圖2 大鼠海馬CA3區P35表達(DAB,×400)

表2 各組大鼠NPY、P35 mRNA表達比較±s,n=12)

3 討 論

隨著分子生物學的發展，以及人們對癲癇發病過程及機制研究的不斷深入，難治性癲癇的基因治療已成為神經分子生物學領域的研究焦點之一。重組腺相關病毒(rAVV)作為轉基因載體具有安全性好，免疫原性低，能夠高效、穩定、長期表達目的基因等優點, 成為目前倍受關注且具廣泛應用前景的載體工具之一〔8〕。本實驗將介導NPY基因的腺相關病毒載體，通過腦室注射的方法轉染至腦內特定靶區，觀察NPY基因對慢性癲癇大鼠海馬組織中P35表達的影響，以探討其在癲癇發病機制中的作用以及NPY基因治療慢性癲癇的可能機制。

NPY即神經肽酪氨酸，是Tatemoto等于1982年首先從豬腦中提取，由36個氨基酸組成的神經肽，作為神經遞質或神經調質廣泛分布于中樞及外周神經系統。NPY在中樞神經系統中主要分布在大腦皮層、海馬、丘腦、下丘腦及腦干等處，尤以海馬內濃度最高。許多研究發現NPY具有明顯的抗癲癇作用。董長征等〔5〕的實驗結果表明，rAAV2/1-hNPY-EGFP基因轉染可以抑制KA誘導的大鼠癲癇發作和海馬神經元放電，并進一步利用電生理學方法觀察到NPY可以抑制大鼠海馬神經元癲癇樣電活動，具有降低神經細胞興奮性的作用〔9,10〕。有研究顯示在培養的神經元中發現NPY能夠通過Y2受體抑制突觸前膜神經元的N型Ca2+通道，降低細胞內Ca2+水平，抑制鈣超載，從而維持了細胞內Ca2+的自穩態〔11〕，并抑制同一神經末梢谷氨酸的釋放，降低神經元的興奮性。但關于NPY抗癲癇作用機制的研究，目前尚處于探索階段，有很多問題期待解決。

Cdk5是脯氨酸限定性Ser/Thr蛋白激酶，參與有絲分裂后神經元的蛋白磷酸化，可分別在KSPXK基序和KSPXX基序磷酸化tau蛋白和神經絲蛋白，調節細胞骨架的穩定性，影響軸突的形態和功能〔12〕。Cdk5主要通過與調節亞單位P35結合而被激活，P35主要分布于中樞神經系統梨狀皮層、海馬(CA1、CA3、齒狀回)、杏仁核和內嗅皮層的分化神經元中(尤以海馬內濃度最高)，是Cdk5主要的調節亞基，又被稱為神經元Cdk5激活劑。雖然Cdk5在細胞和組織中廣泛表達，但其蛋白激酶活性卻主要局限于大腦皮層，尤其是海馬神經元中。實驗表明，Cdk5與其調節蛋白p35在癲癇的發生發展過程中起著非常重要的作用。Cdk5/p35共同參與了神經元骨架蛋白-tau蛋白的磷酸化過程，導致其磷酸化水平的變化，進而誘發海馬MFS和突觸重建〔13〕，從而在癲癇的反復發作中起重要作用。

董長征等〔5〕前期實驗已應用免疫熒光染色方法證明rAAV2/1-hNPY-EGFP在癲癇病理狀態下的腦組織中可以實現有效表達，并觀察記錄了NPY基因過表達對KA誘導慢性癲癇大鼠發作的影響，結果提示，大鼠腦電變化與癲癇大鼠驚厥行為變化相吻合，在癲癇形成中NPY能明顯抑制KA誘導慢性癲癇大鼠海馬神經元放電和癲癇發作。本研究結果顯示，rAAV2/1-hNPY-EGFP腦室內注入可以通過使NPY過表達產生明顯的抗癲癇作用。與此同時A組在注射后2 w和4 w，致癇大鼠反復自發性抽搐發作時，P35 mRNA及蛋白表達均明顯升高，提示KA誘發癲癇的機制可能與KA影響P35轉錄及蛋白水平的表達有關。有研究表明：癲癇反復發作P35的過表達，可激活Cdk5，引起一系列病理生理變化，使神經元處于過度興奮狀態，最終導致腦功能障礙〔14〕。本實驗研究說明NPY的基因過表達有可能是通過下調P35的異常表達而發揮抗癲癇作用，其直接原因有可能是NPY通過降低P35的表達水平，抑制了Cdk5的蛋白激酶活性，使Tau蛋白磷酸化水平發生變化〔3,4〕，從而減弱了MFS和突觸重建〔15〕造成的大腦結構功能的異常改變〔14〕，最終發揮NPY抑制癲癇發作及其神經元保護的作用。

總之，腺相關病毒載體介導NPY為臨床基因治療難治性癲癇提供了一種新的思路和途徑，本研究在前期工作的基礎上進一步研究了NPY基因抗癲癇的可能機制，但其安全性、有效性及其更加完善的抗癲癇機制有待繼續深入研究。

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