ABCE1基因沉默對人肝癌SMMC-7721細胞增殖和遷移能力的影響

白 東 張 建 張春陽

(沈陽醫(yī)學院附屬奉天醫(yī)院普外三科，遼寧 沈陽 110024)

原發(fā)性肝癌在我國惡性腫瘤中死亡率居第二位〔1〕。雖然化療和新輔助化療在肝癌的治療中已得到了廣泛的應用。但是肝癌的預后仍不十分理想，尤其是已發(fā)生臨床轉(zhuǎn)移和腫瘤復發(fā)的患者〔2〕。近年來發(fā)現(xiàn)ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子E1(ABCE1)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，ABCE1的異常表達可能與惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)〔3，4〕。本研究探討ABCE1基因其對肝癌細胞生物學行為的影響。

1 材料和方法

1.1主要材料 人肝癌SMMC-7721細胞購于上海研晶生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM，G418，胰蛋白酶(GIBCO BRL,美國)、胎牛血清(FBS) (中國醫(yī)學科學院血液學研究所)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000TM (美國Invitrogen 公司)；L質(zhì)粒提取試劑盒、RNA 提取試劑Trizol、DNA凝膠純化回收試劑盒(北京天根公司)； DNA marker、T4 DNA連接酶(日本Takara 公司)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)兩步法試劑盒(美國Promcga公司) ， cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日)；RNA干擾序列(珠海英平生物技術(shù)有限公司合成)；PCR 引物序列(Invitrogen 公司化學合成)；CCK-8(上海炎彬化工公司)；兔抗人ABCE1多克隆抗體(美國Abcam公司)；HRP 標記的羊抗鼠IgG(美國Santa Cruz 公司)；鼠抗GAPDH 單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP 標記的兔抗羊IgG(北京博奧森公司)；PVDF膜(美國Bio-Rad公司)；ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)；Matrigel gel(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1siRNA設(shè)計、合成及轉(zhuǎn)染 根據(jù)參考文獻〔5〕設(shè)計靶向人類ABCE1 siRNA序列，正義鏈為：5'-ATCCGCTACAGCGAGTACGTTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAAACGTACTCGCT-TAGCTTTTTTG - 3'；反義鏈為：5'-AATFCAAAAAAGCTACAGCGAGTACGTTTACCCCATCTGTGGCTTCACAGGTAAACGT-ACTCGCTGTAGCG-3'。陰性對照siRNA正義鏈為：5'-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTA-ACATACTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3'；反義鏈為：5'AATTCAAAAAAGCGAGACCTCAGTATGTTACCCATCTGTGGCTTCA-CAGGTAACATACTGAGGTCTCGCG-3'。 均由珠海英平生物技術(shù)有限公司合成，肝癌細胞株SMMC-7721細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃ 5%CO2密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)，傳代。 實驗時取對數(shù)生長期的細胞。按2 × 105個/孔將肝癌細胞株SMMC-7721接種于6孔板中，當融合率達80%時以脂質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時分為三組：轉(zhuǎn)染pGenesil-1-ABCE1-siRNA載體者為SMMC-7721/ABCE1-siRNA組(實驗組)，轉(zhuǎn)染NC siRNA載體者為SMMC-7721/control組(對照組)，未轉(zhuǎn)染的肝癌SMMC-7721為SMMC-7721組(空白組)。于轉(zhuǎn)染后48 h進行 RNA 干擾效應的檢測。

1.2.2RT-PCR檢測 細胞棄培養(yǎng)液后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，通過TRIzol法提取總RNA，用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別擴增ABCE1和內(nèi)參GAPDH。ABCE1引物序列: 上游：5'- TTGGTTGTGGGAAGTCGT-3，下游：5'-GCTTATGTAGTTAATGGGAGGT-3'，擴增產(chǎn)物為415 bp。GAPDH上游：5'-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3'，下游：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'，擴增產(chǎn)物為185 bp。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，UVI 凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 7.0 軟件分析條帶灰度值，用ABCE1/GAPDH 代表ABCE1 mRNA的相對表達量。

1.2.3Westem 印跡檢測 每組收集1×107個細胞，PBS沖洗3次，提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，吸取50 μg總蛋白，去離子水補至20 μl，入等體積2×上樣緩沖液，99℃ 變性10 min。離心后吸取30 μl 上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE 分離后，用半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉，37℃封閉,2 h，加入1∶1 000稀釋的ABCE1多克隆一抗，4℃過夜，TBST 洗膜5次，每次5 min，加入1∶5 000 HRP標記的二抗和GAPDH,于37℃孵育2 h。PBS洗滌，采用ECL法檢測。暗室曝光X光片，沖洗膠片，UVI 凝膠成像系統(tǒng)攝像Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶灰度值，用ABCE1/GAPDH代表代表ABCE1的相對表達量。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期 收集三組細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/L，以冷PBS緩沖液洗滌2次,細胞沉淀用70 %的冷乙醇(4℃) 混勻備用，洗滌細胞，后再用PBS調(diào)細胞濃度為1×106/L與含50 μg/ml RNA 酶的Tris-HCL緩沖液(pH7.4)共同孵育30 min。100 μg/ml (1 μg/ml)碘化丙啶(PI)進行細胞的DNA 染色，暗室中放置1 h 后通過流式細胞儀分析細胞的DNA含量分布，并計算出各個周期細胞所占的百分率。

1.2.5CCK8法檢測細胞增殖 指數(shù)生長期細胞接種于96孔板，調(diào)整細胞密度每孔達到1×103，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μl，每組設(shè)6個復孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-820 μl，培養(yǎng)箱溫育4 h后，以不加細胞空白孔為對照，用酶標儀檢測490 nm處吸光度A值。以細胞吸光度A值平均值為縱坐標，以時間48、72、96及120 h為橫坐標繪制生長曲線。

1.2.6細胞劃痕損傷實驗 在對數(shù)生長期將上述3種細胞分別以5×103個/孔的密度接種于6孔板，待培養(yǎng)的各組細胞生長形成細胞單層后，用10 μl移液槍頭或無菌牙簽在單層細胞上呈“一”字劃痕。PBS輕柔洗滌，每孔加入2 ml不含血清的DNEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于48 h后倒置顯微鏡100倍下觀察細胞遷移情況。

1.2.7TransweⅡ小室侵襲實驗 在聚碳酸酯微孔濾膜上鋪Matrigel 50 μg/孔，在聚合好的小室下室加入10%的胎牛血清做條件培養(yǎng)液，在上室加入按上述3種細胞處理過的SMMC-7721細胞懸液100 μl(細胞總數(shù)為3×105/L)，置于培養(yǎng)箱中24 h后取出，以棉簽小心刮除濾膜上室面未穿過的瘤細胞，95%的乙醇固定5 min，PBS輕輕漂洗三遍，蘇木精染色10 min，PBS緩沖液沖洗小室，自然晾干，將上室的聚碳酸酯濾膜沿邊緣用手術(shù)刀片小心取下，用樹脂膠固定于玻片上(膜內(nèi)面朝上)，封片；干燥后在200×光鏡下每膜計數(shù)上、下、左、右、中5個視野的侵襲細胞數(shù)，計算平均值。每組平行設(shè)3個小室，重復3次。

2 結(jié) 果

2.1siRNA抑制ABCE1 mRNA的表達 ABCE1 mRNA表達的RT-PCR檢測顯示：與對照組和空白組比較(0.70±0.05,0.69±0.07)，實驗組條帶明顯變窄(0.36±0.04,P<0.05)。見圖1。

2.2siRNA抑制ABCE1蛋白的表達 ABCE1蛋白表達的Western 印跡檢測顯示：與對照組和空白組比較(0.84±0.05,0.85±0.07)，實驗組條帶明顯變窄(0.66±0.04,P<0.05)。見圖2。

2.3細胞周期檢測 流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示，G0/G1期，實驗組較對照組和空白組略有增加，S期略有減少(P<0.05)。M期細胞無明顯變化(P>0.05)。說明有明顯的S期阻滯。見表1。

2.4siRNA對細胞增殖的影響 依CCK-8法檢測結(jié)果繪制的生長曲線示實驗組較對照組和空白組曲線明顯降低(P<0.05)。見圖3。

圖1 RT-PCR檢測SMMC-7721細胞中ABCE1 mRNA的表達

圖2 Western 印跡檢測SMMC-7721細胞中ABCE1蛋白的表達

表1 siRNA抑制ABCE1表達對SMMC-7721細胞周期的影響±s，n=3，%)

圖3 ABCE1 siRNA對SMMC-7721細胞生長的影響

2.5細胞劃痕損傷實驗結(jié)果 48 h后實驗組細胞劃痕愈合緩慢，而M對照組和空白組細胞劃痕已基本長滿，說明實驗組遷移能力顯著下降。見圖4。

2.6SMMC-7721細胞體外侵襲力的變化 對照組和空白組穿過濾膜的細胞數(shù)量較多分別為(78.64±4.83)和(77.90±4.38)，實驗組穿膜細胞數(shù)為(46.42±3.61)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明特異性干擾ABCE1基因表達可能有效降低SMMC-7721細胞的侵襲力。見圖5。

圖4 細胞劃痕損傷實驗結(jié)果

圖5 小室侵襲實驗結(jié)果

3 討 論

腫瘤的發(fā)生是一個多階段逐步演變的過程，細胞通過一系列進行性的改變而向惡性發(fā)展〔6〕。這期間涉及許多基因的改變，其中既有原癌基因的激活和高表達的發(fā)生，也有抑癌基因和凋亡基因的失活，還涉及大量細胞周期調(diào)節(jié)基因功能的改變〔7～9〕。許多研究顯示在腫瘤演變向惡性發(fā)展過程中存在一種調(diào)控分子在控制這些基因的表達變化，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)研究提示ABCEI基因就是這么一種新的“調(diào)控分子”，參與了腫瘤的形成和發(fā)展。

ABCEI基因定位于常染色體4q31上，是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子亞家族的成員之一，具有高度的保守性，編碼一種名為核糖核酸酶L(RNase L)抑制因子的68 kD蛋白〔10〕。該蛋白能夠阻斷干擾素介導的細胞抗病毒2-5A/RNase L通路，抑制細胞凋亡過程，并可在促進蛋白質(zhì)合成及細胞增殖分化方面發(fā)揮作用〔11〕。有研究〔12〕表明，在腫瘤細胞系中抑制ABCE1的表達可明顯阻礙腫瘤細胞的生長。提示ABCE1的表達與腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，理論上阻斷腫瘤細胞中ABCE1的表達可起到治療腫瘤的作用。

越來越多的證據(jù)表明，ABCE1與癌細胞生長調(diào)控和遷移侵襲密切相關(guān)。本研究用使用RNA 干擾技術(shù)抑制肝癌SMMC-7721細胞ABCE1基因的表達后，細胞的生長速度明顯減慢，遷移能力顯著下降，ABCE1基因沉默后S期細胞數(shù)明顯減少，細胞被阻滯在G0/G1期。同時劃痕試驗和小室侵襲實驗表明ABCE1基因沉默后肝癌SMMC-7721細胞的遷移能力和侵襲能力降低。與趙艾君等〔13〕對肺癌95-D/NCI-H446細胞的研究結(jié)果相同。

總之，ABCE1基因不僅與腫瘤細胞的遷移能力和侵襲能力變密切相關(guān)，而且在促進腫瘤細胞增殖方面起著重要作用〔14〕。特異性干擾ABCE1基因表達可抑制肝癌SMMC-7721細胞的遷移能力，并抑制腫瘤細胞增殖，因此，ABCE1的siRNA序列可能成為治療肝癌的有效靶點。干預ABCE1可能會為肝癌等惡性腫瘤的治療提供新的思路。

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