電針穴位刺激治療對大鼠脊髓急性損傷運動功能及神經生長因子表達的影響

路銀芝

(河南經貿職業學院，河南 鄭州 450000)

受急性運動或外界暴力因素造成的脊髓損傷(SCI)是一種常見病，且致殘率高〔1〕。相關研究提示，哺乳動物脊髓損傷所致肢體癱瘓或運動功能障礙的主要病因與脊神經損傷有關，而脊神經損傷后，通過內源性修復產生的新生神經細胞極少，也難以啟動功能性軸突再生〔2〕，故后期康復較難。電針療法是將電流刺激和針刺結合起來治療疾病的方法，例如楊拯等〔3〕研究指出，督脈電針能夠治療脊髓損傷，促進肢體功能康復；也另有相關成果從理論分析和實踐研究的角度對其進行了闡述，多數認為促進肢體功能康復的主要原因應與脊神經的再生和重建有關。本研究通過建立脊神經急性損傷大鼠模型，對其進行電針穴位刺激治療，觀察大鼠肢體運動功能恢復和神經生長因子(NGF)表達的效果。

1 資料與方法

1.1實驗材料 Wistar健康大鼠(購自鄭州大學醫學院動物飼養中心)，雄性，清潔級，8～10周齡，體重(162±12) g；脊髓損傷大鼠建模成功后，將實驗組和對照組大鼠分籠飼養(動物房合格證號：豫醫動字第4104022號)，室溫控制在24℃左右，室內通風良好，由專人統一飼養和料理；每天腹腔注射青霉素8×104U，連續3 d，同時每日兩次對大鼠進行清理和消毒，避免傷口感染；每天擠壓膀胱輔助排尿3次，至膀胱功能恢復為止；每8 h對大鼠喂食一次，食量以大鼠自由進食為主配以針管經口腔注喂流體食物為輔，兩組大鼠于護理期間無死亡。SDZ-IV型電針治療儀(蘇州醫療用品廠有限公司)；NGF與腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)抗體(購自Santa Cruz公司)；注射用青霉素鈉(石藥集團中諾藥業有限公司產品，批號：09119209)以及生理鹽水等相關常用藥械。

1.2脊髓損傷模型的建立 取實驗對象Wistar大鼠45只備用，雄性，清潔級，標記每只大鼠的周齡和體重。用特制椎板鉗咬除實驗動物T8及T9棘突及椎板，顯露硬膜。使用動脈瘤夾子，直接鉗夾T9段脊髓約0.5 s，操作方法：用改良的動脈瘤夾子盡量咬除T9段棘突及椎板，標定力量為35 g，用持夾器將動脈瘤夾打開，然后突然釋放動脈瘤夾，使脊髓受到突然的暴力打擊，打擊用時約0.5 s，操作過程中確保動脈瘤夾的位置準確。相關研究〔4〕指出：該法能保持硬脊膜的完整性，且脊髓損傷后的解剖結構與神經功能的變化與挫傷型脊髓損傷非常相似，且力量從2～98 g過程中發現鉗夾力越大，損傷區域殘存的軸突越少，功能恢復越不理想。故，本研究標定力量為35 g。以快速擠壓造成脊髓急性完全損傷，建立脊神經急性損傷模型。以鼠尾痙攣性擺動、雙下肢癱為損傷標準。選取造模成功進入實驗動物30只，隨機分成實驗組和對照組，每組15只，2組大鼠體重、周齡、下肢癱瘓程度等基本指標無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

1.3治療方法 實驗組：固定狀態下電針穴位刺激，于建模后第4天開始治療。治療過程：取大鼠俯臥位， 將頭部和四肢捆綁固定，選損傷段上下2個椎體的“夾脊穴”作為電針穴位，將治療儀上的兩根長25 mm直徑0.2 mm的針灸針刺入所選穴位，正極接近頭端，負極接近尾端，采用疏密波，頻率為10/50 Hz，電流強度以大鼠后肢出現顫動為度，留針治療25 min/次，每日1次。對照組：固定狀態下假電針穴位刺激，假電針取穴同電針治療組，進針后不予電刺激，其他治療過程、治療方法及治療時長等，均同實驗組。2組大鼠均于建模后第4天開始治療，每天治療1次，每次治療25 min，共計治療60 d。

1.4療效評價 ①后肢運動功能評估：采用BBB運動功能評分系統對兩組大鼠后肢運動功能進行評估。分別在第1次電針治療后的第10、20、30、40、50、60天，由同一實驗人員，參照BBB評分法細則，連續對實驗大鼠后肢運動功能進行單盲法評分。BBB評分標準將大鼠后肢運動分為22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分，具體方法和內容詳見文獻〔5〕。

②NGF和BDNF檢測：第61天采用斷頭法統一處死2組大鼠，開胸，經心灌注200 ml 4℃的生理鹽水沖去血管中的血液，然后灌注4%的4℃的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4)500 ml。灌注固定30 min后，取損傷區T8及T9段脊髓放入4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液24 h以上，于切片前先天晚上在最接近橫斷處切下1 cm放入20%蔗糖溶液中4℃過夜，石蠟包埋，用恒冷切片機連續切片，片厚25 μm。疫組織化學染色嚴格按照試劑盒操作說明進行，以PBS代替一抗作陰性對照。每只大鼠隨機取5張切片，運用圖像分析卡(北京天地公司產)，IBM586和Olympus Bx60顯微鏡組成的圖像處理系統觀測，計算陽性反應胞體的數量。分別計算各組NGF、BDNF陽性細胞的平均值。

2 結 果

2.1BBB評分比較 建模前所選備用大鼠BBB評分均為21分。建模后至第3天(電針治療前一天)兩組大鼠均表現為完全截癱，BBB評分為0分。電針治療第10天至第20天，對兩組大鼠后腿進行針刺，有回縮反應，但組間差異不明顯。經在第30天及在之后的天次檢測過程中，發現治療組后肢運動功能日趨明顯,且顯著優于對照組，電針治療第30、40、50、60天，兩組評分差異有統計學意義(均P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2NGF和BDNF檢測比較 發現經60 d電針穴位刺激治療，治療組NGF和BDNF蛋白表達量顯著高于對照組(均P<0.01)。見表2。

表1 電針治療期間兩組大鼠后肢活動功能BBB評分比較(n=15,±s)

表2 兩組大鼠NGF和BDNF免疫組化陽性表達比較(個，n=15,±s)

3 討 論

SCI造成的肢體癱瘓或下肢功能障礙，是臨床醫學面臨的一個世界性難題。多數研究認為，神經系統受損造成大量神經元缺失后，因不能產生新的神經元建立新的突觸聯系，是致使患者難于康復的主要病因〔6〕?？梢?，如何促進神經元再生并建立新的突觸聯系應成為臨床治療的關鍵。電針療法是在傳統中醫的基礎上發展起來的一種現代物理療法，具有電流刺激和針刺雙重治療的作用。相關研究提示，電針治療不但可以改善血液循環促進患體代謝和修復，而且利于抵抗自由基，減少繼發性損害，并且具有降低Ca2+含量，保護損傷神經、抑制細胞凋亡和恢復神經元興奮性的作用〔7,8〕。例如，劉麗霞〔9〕、陳虹等〔10〕研究證實，電針刺激治療可以促進受損神經元的軸突再生；郭召〔11〕、鄧娜等〔12〕也研究表名，電針治療不但具有維護神經元的自我保護機制，也可激發神經元的發育和生長，進而利于患體建立新的突觸聯系及肢體功能恢復。

本研究對脊髓急性損傷大鼠進行了電針穴位刺激治療，通過觀察NGF和BDNF蛋白量的表達情況及肢體運動功能康復的效果，以探討電針刺激的療效和相關治療機制。經在第30天及在之后的第40、50、60天檢測中，發現治療組(電針組)后肢運動功能日趨明顯優于對照組(假電針組)，t值依次為3.175、6.976、5.163和6.425，均P<0.05或P<0.01，評分差異有統計學意義。60 d治療后，經對兩組大鼠NGF與BDNF蛋白量表達情況檢測，發現治療組NGF和BDNF蛋白量表達情況高于對照組，均P<0.01，差異具有顯著性。NGF是一類已被證實的能夠促進和維持神經生長、生存、分化和執行功能的特種蛋白，還可挽救損傷的神經元〔13〕；BDNF是神經營養因子家族中重要成員，它與NGF有50%同源性〔14〕，不僅在中樞神經系統發育過程中對維持神經元正常的生理功能等方面起重要作用，還可誘導神經突起定向生長等?？梢?，NGF和BDNF是干預神經修復機制的重要物質，對神經成長與修復的效果有著重要的影響，也就是說NGF和BDNF物質表達的效果將直接影響著神經修復的效果。故SCI的大鼠電針刺激治療后，顯著提高NGF和BDNF蛋白的表達有助于促進神經元的再生并建立新的突觸聯系，進而利用下肢運動功能的恢復。所以，研究提示，電針穴位刺激利于SCI大鼠NGF和BDNF蛋白的表達及下肢運動功能的恢復，而肢體功能恢復應與NGF和BDNF的表達促進神經元再生并建立新的突觸聯系有關，且電針療法是簡便易行，無副作用、安全可靠，值得臨床實踐治療和進一步深入研究。

4 參考文獻

1陳啟波.針灸結合康復治療干預時機對不同程度脊髓損傷患者神經功能恢復的影響〔J〕.中國老年學雜志,2011;31(5):772-3.

2張延潔,蔡 芳,楊一峰.中老年人骨髓間質干細胞的生物學特性研究〔J〕.中國生物工程雜志,2005;25(4)：33．

3楊 拯,何彥芳,陳建敏,等.電針在脊髓損傷功能康復中的研究〔J〕.時珍國醫國藥,2011;22(1):249-50.

4祖 波,尹宗生.機械性脊髓損傷模型的建立及其評價〔J〕.中國臨床康復,2006;10(12):151-3.

5顧搖兵,金建波,李華南,等.脊髓損傷動物模型的運動功能評價〔J〕.中國藥理學通報,2011;21(7):893-7.

6陳 蓉.電針聯合藥物治療結核性腦膜炎臨床療效比較〔J〕.現代預防醫學,2012;39(15):4004-5.

7韋登明,賈學敏,尹向旭,等.電針改善血管性癡呆大鼠學習記憶及其與海馬神經細胞蛋白激酶C表達的關系〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(2):328-30.

8胡嘯玲,周忠群,周志剛,等.電針麻醉方法對大白鼠外傷疼痛IL-2、sIL-2R、IFN-γ的影響〔J〕.現代預防醫學,2011;38(10):1922-3.

9劉麗霞,邰浩清.電針對脊髓損傷作用機制的研究〔J〕.長春中醫藥大學學報,2011;27(3):405-6.

10陳 虹,李俊岑,黨彥麗,等.電刺激對大鼠脊髓損傷后神經生長因子表達的影響〔J〕.中國康復理論與實踐,2012;18(1):33-6.

11郭 召,丁文元.脊髓損傷治療的最新研究進展〔J〕.頸腰痛雜志,2010;31(2):139-42.

12鄧 娜,高 敏.電針治療脊髓損傷的基礎理論研究〔J〕.甘肅中醫,2009;22(3):11-2.

13陳 良,劉 陽.骨髓基質干細胞移植對大鼠脊髓損傷區NGF與BDNF表達的影響〔J〕.四川醫學,2011;32(3):320-2.

14戈宏焱,陳 博,萬有貴.柴胡皂苷對抑郁癥大鼠海馬BDNF表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2012；32(6):1209-10.