全麻藥丙泊酚通過上調(diào)MT-3減輕沙鼠全腦缺血再灌注損傷

韓 彬 趙俊鶯 向富森 舒 雅

(西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710077)

缺血性腦血管病(ICVD)在腦血管疾病中最為嚴重，大約占80%〔1〕，嚴重威脅著人類的健康和壽命。丙泊酚(Propofol)是臨床上常用的靜脈麻醉藥，其半衰期短，麻醉作用較為明顯，有研究證明，Propofol對腦出血以及腦缺血都有較好的腦保護作用。金屬硫蛋白(MT)富含半胱氨酸的低分子量蛋白質(zhì)，廣泛分布于生物體。MT家族有4種異構體，分別為MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。MT-3是被廣泛研究的新基因，有肝臟合成、抗衰老等多種重要生物學功能〔2〕。Propofol可以通過上調(diào)MT-3保護海馬神經(jīng)元細胞。本研究擬通過建立沙土鼠腦缺血再灌注損傷模型(CIRM)，探討Propofol通過上調(diào)MT-3基因mRNA的表達量減輕ICVD損傷。

1 材料與方法

1.1對象 健康雄性清潔級蒙古沙土鼠30只，體重〔55～75平均(65±5)〕g，浙江省實驗動物中心提供。

1.2實驗藥品 Propofol(意大利 AstraZeneca 公司產(chǎn)品，規(guī)格為 200 mg：20 ml)，大鼠組胺試劑盒 (RapidBio Lab)；MT-3抗體(Sigma公司)、HRP標記的兔抗鼠二抗(Chemicon公司)。

1.3造模 沙土鼠均在術前 24 h禁食，自由飲水。腹腔注射3%戊巴比妥鈉 45 mg/kg麻醉。麻醉后， 分離雙側(cè)頸總動脈，然后用無損傷微動脈夾，同時夾斷雙側(cè)頸總動脈血，檢查遠端血流情況以確保完全阻斷血流造成腦缺血模型。腦缺血10 min后，松開動脈夾恢復腦血流2 h即為CIRM。

1.4分組 將沙土鼠用隨機數(shù)列表分為假手術組、模型組和Propofol組。假手術組僅游離雙側(cè)頸總動脈但不阻斷腦血流；模型組及Propofol組建立CIRM,Propofol組在再灌注即刻，經(jīng)舌靜脈泵注射Propofol 10 mg·kg-1·h-1，模型組用等量生理鹽水代替，維持2 h。實驗維持期間鼓膜溫度為36.5℃～37.5℃；再灌注2 h處死大鼠。

1.5神經(jīng)功能評分 沙鼠在再灌注2 h后開始表現(xiàn)一定程度的神經(jīng)功能損傷行為，給予Propofol治療后，其神經(jīng)功能有一定程度的恢復，評分細則和評分見表1。

表1 Garcia JH評分標準

1.6RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞內(nèi)MT-3基因的表達 RT-PCR方法:擴增MT-3 基因片段大小為217 bp,上游引物為:5'-GACCTGCCCCTGCCCTTCTGGTGG-3'，下游引物為5'-GCTCCACACGGAGGGGTGCCTTCT-3'。PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分析。應用熒光化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行結果分析。

1.7Western 印跡法檢測 取大鼠海馬組織標本稱重,每克組織加入10 ml細胞裂解緩沖液,冰上機械勻漿,4℃以10 000 r/min離心10 min,離心半徑為10 cm,取上清液,用Bradford法測定蛋白含量,取蛋白樣品加等體積的2×電泳樣品緩沖液加熱變性,以20 μg蛋白/泳道上樣,經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。麗春紅S染色確定轉(zhuǎn)膜,并標記蛋白質(zhì)標準參照物位置,用5%脫脂奶粉封閉。依次加入MT-3抗體及二抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色,用GIS系統(tǒng)定量掃描灰度值。

1.8腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)測定 將各組腦組織勻漿用0.9%鈉溶液按質(zhì)量制備 10%的腦組織勻漿(體積比為1∶9)，勻漿中取樣品采用722型光柵分光光度計分別測定腦組織中 SOD、MDA、NO值。

2 結 果

2.1神經(jīng)功能評分 假手術組的Garcia JH評分為17.1±0.25，模型組為8.51±0.52，Propofol組為12.82±0.68；假手術組與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)； 模型組與Propofol組比較統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2MT-3 mRNA的相對表達 RT-PCR半定量結果顯示：Propofol組的MT-3基因mRNA的表達水平(208.6±14.83)與假手術組(45.7±8.52)、模型組(23.5±4.57)對比差異顯著(P<0.05)。見圖1。

圖1 MT-3 mRNA的相對表達

2.3海馬組織MT-3的蛋白相對表達 Western結果顯示，Propofol組的MT-3蛋白表達量(84.5±15.4)明顯高于假手術組(38.6±8.21)與模型組(21.7±3.69)(P<0.01)。見圖2。

圖2 MT-3的蛋白相對表達

2.4Propofol對沙鼠腦組織SOD、MDA、NO的影響 Propofol組大鼠腦組織 SOD、MDA和NO分別為88.1±8.9，0.91±0.27和0.51±0.18；假手術組為45.6±7.1，2.10±0.62和3.56±0.67；模型組為64.9±9.5，1.67±0.41和1.82±0.51。假手術組與模型組SOD比較有統(tǒng)計學意義(P<0.000 01)； 模型組與Propofol組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.000 01)。假手術組與模型組MDA比較有統(tǒng)計學意義(P<0.000 01)；模型組與Propofol組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.000 01)。假手術組與模型組NO比較有統(tǒng)計學意義(P<0.000 01)； 模型組與Propofol組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.000 01)。

3 討 論

腦缺血再灌注損傷重要原因是基損傷〔3〕。在正常情況下，SOD可以根據(jù)生理性需要及時消除或生成，是由于機體的代謝損傷而產(chǎn)生。在大腦缺血情況下，自由基清除酶活性降低，自由基增多〔4〕。生成大量ROS后，導致蛋白質(zhì)降解、核酸斷裂、最終死亡。腦缺血再灌注損傷時，MDA、NO 參與了損傷過程，SOD 則阻斷此過程，SOD、MDA、NO等自由基損傷的指標與腦缺血再灌注損傷密切相關〔5〕。

Propofol具有較強的抗氧化性,具有顯著的大腦保護作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Propofol具有與巴比妥類藥物相似的保護作用，包括降低腦代謝率和神經(jīng)細胞能量消耗，減輕腦水腫。此外Propofol還能減少興奮性氨基酸的產(chǎn)生，減少鈣內(nèi)流等〔6〕。實驗〔7〕證明Propofol能抑制CIRM神經(jīng)元凋亡，阻止延遲性神經(jīng)元死亡，可以通過上調(diào)MT-3保護海馬神經(jīng)元細胞。

本研究結果表明Propofo通過上調(diào)MT-3量，增加SOD活力，降低MDA和NO從而降低自由基損害，減輕 NO 的毒性作用而減輕腦缺血損傷。Propofol可以通過上調(diào)MT-3保護大鼠ICVD。

4 參考文獻

1Kumar R,Azam S,Sullivan JM,etal. Brain ischemia and reperfusion activates the eukaryotic initiation factor-alpha kinase,PERK 〔J〕. J Neurochem,2001;77(5):1418-21.

2He J,Huang C,Jiang J,etal. Propofol exerts hippocampal neuron protective effects via up-regulation of metallothionein-3〔J〕. Neurol Sci,2013;34(2):165-71.

3Wilson JX,Gelb AW.Free radicals,antioxidants,and neurologic injury:possible relationship to cerebral protection by anesthetics〔J〕. J Neurosurg Anesthesiol,2002;14:66-79.

4Gehrau RC,Mas VR,Dumur CI,etal.Regulation of molecular pathways in ischemia-reperfusion injury after liver transplantation〔J〕. Transplantation,2013;27.

5張 曙,謝海輝,唐興寧.丙泊酚引起長時間的逆行性遺忘2例報告〔J〕.麻醉與監(jiān)護論壇,2009;16(1): 70-1.

6李 玲，馬瑜紅，王素青.烏附經(jīng)方預處理對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結合雜志，2013;33(6):789-94.

7Bonney S,Kominsky D,Brodsky K,etal. Cardiac per-functions as novel link between fatty acid metabolism and myocardial inflammation during ischemia and reperfusion Injury of the heart〔J〕. PLoS One,2013;8(8):e71493.