硫辛酸對糖尿病腎病大鼠的血清晚期糖基化終末產物及氧化應激的影響

孫鳳娟 劉亞平

(濟寧市第一人民醫院內分泌二科，山東 濟寧 271000)

近年來，氧化應激在糖尿病腎病(DN)發病機制中作用引起人們的廣泛關注〔1〕，而高糖介導的腎小球和腎小管細胞凋亡是引起腎功能惡化的一個重要原因〔2〕，有研究指出，高糖高脂飼料聯合鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠造模成功后喂養6～8 w，腎臟已出現形態學改變〔3〕，本研究探討硫辛酸(LA)對DN大鼠的血清晚期糖基化終末產物(AGEs)及氧化應激的影響，并觀察腎臟AGE(RAGE)的表達情況。

1 材料和方法

1.1材料 3月齡健康雌性Wistar大鼠30只〔山東大學實驗動物中心提供,合格證號：SCXR(魯)20030004〕，平均體重(276.36±7.79)g。普通飼料和高糖高脂飼料(普通飼料中添加10%豬油、10%蛋黃粉和20%蔗糖)〔4〕均由山東大學實驗動物中心提供。STZ購自Sigma公司，用前以0.1 mmol/L，pH4.2的檸檬酸鹽緩沖液溶解，新鮮配成2%STZ溶液，經濾菌器除菌。

1.2方法

1.2.1造模 實驗前大鼠適應性喂養1 w，按體重編號，隨機取6只作正常組，喂以普通飼料。余24只大鼠作糖尿病造模組，高糖高脂飼料喂養8 w(不限每日熱量)，禁食12 h后左下腹腔注射STZ(30 mg/kg，隔2 w 1次，共2次)，正常對照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。末次STZ注射1 w后糖尿病造模組尾靜脈行腹腔內葡萄糖耐量試驗(IPGTT)〔5〕。以空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L，或糖負荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L者為糖尿病造模成功鼠〔6〕。繼續喂養8 w，糖尿病大鼠以隨機血糖≥16.0 mmol/L伴胰島素敏感性下降，并出現微量白蛋白尿為糖尿病腎病造模成功鼠〔3〕，剔出因感染死亡和造模未成功的大鼠，入選DN造模成功鼠為16只，按血糖水平隨機分為DN組和LA組，每組8只，分別給予生理鹽水和LA(50 mg·kg-1·d-1)1 ml腹腔注射4 w，每周按體重調整各組注射劑量。

1.2.2觀察指標 成模后所有大鼠每周固定時間測隨機血糖和體重，共觀察4 w。實驗結束時，三組大鼠留取24 h尿，檢測尿蛋白，次日空腹8 h后頸動脈穿刺取血處死。分離血清以檢測FPG、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白酶固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)(比色法，全自動生化分析儀)；血清胰島素(FINS)(試劑盒購自天津九鼎醫學生物有限公司，批內變異系數<10%，批間變異系數<15%，由我院核醫學科測定)、丙二醛(MDA)、硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)(試劑盒均購自南京建成)；抗凝血糖化血紅蛋白(GHbA1c)(比色法，試劑盒購自南京建成)；用熒光分光光度計在340 nm波長激發光和456 nm發射光下，考馬斯亮藍法測定稀釋液的蛋白質濃度，以此血清AGEs含量間接反映腎組織AGEs含量。提取三組大鼠腎臟總RNA，利用RT-PCR方法檢測大鼠腎臟RAGE基因表達。計算胰島素敏感指數(IAI)=In(1/FINS×FPG)，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5〔2〕。

1.2.3儀器設備 RF5301PC型紫外熒光分光光度計(日本島津)、MDF-382E型Ultra-low Temperature Freezer(日本SANYO電子化學有限公司)、ZDX-35型自動不銹鋼座式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)、DYY-12型電泳槽(北京六一儀器廠)、Alpha MutiImage Light Cabinet Filter Positions凝膠成像系統。

1.3統計學處理 應用SPSS14.0統計軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結 果

2.1三組大鼠體重、隨機血糖的變化 與普通飼料喂養的正常組大鼠比較，造模組大鼠高脂飲食8 w后體重明顯增加(P<0.01)，增重8.8%，此后DN組及LA組體重有所下降，至實驗結束，DN組大鼠體重顯著高于正常組，LA組與正常組無顯著性差異；單純高脂飲食8 w，兩組大鼠血糖沒有顯著性差異，注射兩次STZ 1 w后DN造模組大鼠血糖明顯升高并且高血糖癥持續存在，隨機血糖平均(16.82±7.68)mmol/L，LA組隨機血糖平均(13.36±5.72)mmol/L。

2.2三組大鼠血AGEs、胰島素及胰島素抵抗(IR)等的變化 與正常組比較，DN組和LA組大鼠血AGEs、GHbA1c、FPG、FINS及HOMA-IR均升高，IAI下降(P<0.01),說明存在IR；與DN組大鼠比較，LA組大鼠血AGEs、GHbA1c、FPG、FINS及HOMA-IR下降(P<0.05)，IAI上升(P<0.05)。見表1。

2.3三組大鼠血脂、24 h尿蛋白水平的變化 與正常組比較，DN組大鼠血TC、TG、LDL-C、24 h尿蛋白均升高(P均<0.05)，說明存在脂代謝、腎功能紊亂；與DN組大鼠比較，LA組大鼠血TC、TG、LDL-C、24 h尿蛋白下降(P<0.05)；三組大鼠HDL-C無明顯變化。見表2。

表1 三組大鼠血AGEs、GHbA1c、FPG、FINS、IAI、HOMA-IR的比較

表2 三組大鼠血脂的比較

2.4三組大鼠氧化應激指標的變化 與正常組比較，DN組大鼠血MDA、SOD均升高(P<0.05),與DN組比較，LA組血MDA、SOD均下降，血GSH-Px增加，但差異無顯著性(P>0.05)。見表3。

2.5三組大鼠RAGE的RT-PCR結果 腎組織總RNA OD260/OD280均介于1.7～2.0之間，說明總RNA純度較高，基本沒有蛋白質污染。甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳示28S與18S的光密度比值約為2，說明總RNA的完整性較好，基本無降解。LA組和DN組均檢測到腎臟組織RAGE的表達，正常對照組未檢測到RAGE表達。見圖1。

表3 三組大鼠血MDA、GSH-Px、SOD的比較

圖1 三組大鼠腎臟RAGE基因的PT-PCR

3 討 論

肥胖患者體內氧化應激水平升高，容易誘發多種慢性疾病，如腫瘤、糖尿病、心腦血管疾病等〔7〕，使用有效的抗氧化劑對降低上述慢性疾病的發生具有重要意義。本實驗對以往的研究方法〔3，5〕，采用高糖高脂飼料喂養結合腹腔兩次小劑量STZ注射的方法誘導建立雌性大鼠糖尿病模型，結果該模型大鼠的血糖、GHbA1c升高，空腹FINS、HOMA-IR升高，高糖高脂喂養8 w后體重增重8.8%，并具有脂代謝紊亂的特點，比較接近人類2型糖尿病的發病特征，繼續喂養8 w造模組大鼠24 h尿蛋白顯著升高，是研究人類2型DN較理想的動物模型。LA干預后，上述指標均有顯著性下降，提示其可以針對自由基對胰島細胞、血管內皮的攻擊產生保護作用〔8〕。本實驗糖尿病組大鼠SOD升高，可能是機體采取的適應性反應〔9〕。

糖尿病時，葡萄糖等還原糖可與蛋白質、脂質、核酸在非酶糖化條件下形成AGEs并在體內沉積；炎癥、腎功能不全和神經衰退性疾病時，氧化應激增加也可產生大量的AGEs〔10〕，程序性死亡配體(PDL)1與其受體PD1途徑傳遞抑制信號，減弱免疫應答，抑制細胞增殖及釋放細胞因子，杜宣等〔11〕發現AGEs作用下的人臍靜脈血管內皮細胞株(HUVEC)表面PDL1分子呈上調性表達，進一步實驗證實，外源性AGEs可誘導HUVEC過量表達單核細胞趨化蛋白1、細胞間黏附分子(ICAM)1、血管細胞黏附分子(VCAM)1等促炎因子〔12〕,而LA能逆轉此現象，可以推測LA減輕糖尿病患者血管炎癥部位的內皮細胞的炎性反應。在糖尿病人或動物模型時，視網膜、系膜細胞和主動脈上均有伴AGEs沉積的高水平的RAGE表達。AGEs-RAGE結合后，可誘導產生氧化應激，生成大量氧自由基，從而激活對氧自由基敏感的轉錄因子核因子(NF)-κB，從而誘導細胞因子胰島素樣生長因子(IGF)-1、腫瘤狀死因子(TNF)-α和黏附分子的產生,導致腎小球、腎小管細胞的分化、生成和作用受損。本實驗提示LA可能通過干預上述通路發揮腎臟保護作用。

DN的發病機制中存在氧化應激〔1，13〕，體外試驗證實高糖本身直接加劇體外培養的內皮細胞和腎小球系膜細胞的氧化應激〔14，15〕。飲食中加入抗氧化劑能預防和減輕糖尿病慢性并發癥，Craven等〔16，17〕指出維生素E、維生素C、α-LA等能減輕糖尿病腎損害，每天大劑量維生素E攝入(1 600～1 800 IU/d)或者短期(3個月)口服LA(300～600 mg/d)能減輕1型和2型臨床糖尿病腎病患者的尿蛋白，并且減輕1型糖尿病患者早期腎臟高濾過〔18〕，與此同時Melhem等〔17〕發現糖尿病大鼠每天攝入維生素C(1 g/kg)、維生素E(100 IU/kg)2個月，并沒有持續抑制尿白蛋白排泄率、腎小球體積、腎小球或腎小管TGF-β含量、腎小球Ⅳ型膠原α1含量，相反，每天給予LA(30 mg/kg)組糖尿病大鼠，上述指標及MDA顯著性下降，提示LA通過氧化應激參與有效的腎臟保護機制。本實驗與前述研究結果相符。

本實驗LA干預后血AGEs含量減少，腎組織中檢測出RAGE表達，支持李雪竹等〔19〕的研究，其實驗指出LA治療組24 h尿蛋白定量減少，腎小球系膜擴張、基質增生、腎小管上皮空泡變性等病理改變減輕，MDA和尿中DNA氧化損傷標志物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平下降，過氧化物酶(CAT)和GSH增加，血AGEs含量減少，RAGE表達下調，提示DN時循環和腎組織局部AGEs含量增高，RAGE表達上調，LA可通過減少氧化應激而抑制AGEs生成及下調RAGE表達，進而改善DN大鼠腎組織結構和腎功能，在防治DN方面有良好的應用前景。

4 參考文獻

1Vasavada N,Agarwal R.Role of oxidative stress in diabetic nephropathy〔J〕.Adv Chronic Kidney Dis，2005；12(2)：146-54.

2Menini S,Iacobingi C,Oddi G,etal.Increased glomerular cell(podocyte) apoptosis in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus：role in the development of diabetic glomerular disease 〔J〕.Diabetologia, 2007；50(12)：2591-9.

3宋恩峰，劉晶晶，賈汝漢.2型糖尿病腎病大鼠模型制備研究〔J〕.實用醫學雜志，2007；23(18)：2840-2.

4李愛卿，王志慧，趙躍斌.高糖高脂飼料誘導2型糖尿病大鼠模型〔J〕.臨床醫藥實踐雜志，2005；14(2)：130-1.

5Vital P，Larrieta E，Hiriart M.Sexual dimorphism in insulin sensitivity and susceptibility to develop diabetes in rats〔J〕.Endocrinol，2006；190：425-32.

6司曉晨，尚文斌，卞慧敏，等.鏈脲佐菌素加高脂膳食誘導2型糖尿病大鼠模型〔J〕.安徽中醫臨床雜志，2003；15(5)：383-5.

7Packer L,Kraemer K,Rimbach G.Molecular aspects of lipoic acid in the prevention of diabetes complications 〔J〕.Nutrition，2001；17：888-95.

8Bhatti F,Mankhey RW,Asico L,etal.Mechanisms of antioxidant and pro-oxidant effects of alpha-lipoic acid in the diabetic and non-diabetic kidney〔J〕.Kidney Int，2005；67(4)：1371-80.

9Arivazhagan P,Ramanathan K,Panneerselvam C.Effect of DL-lipoic acid on mitochondrial enzymes in aged rats〔J〕.Chem Biol Int，2001；138(2)：189-98.

10Sousa MM,Du Yan S,Fernandes R,etal.Familial amyloid polyneuropathy：receptor for advanced glycation end products-dependent triggering of neuronal inflammatory and apoptotic pathways〔J〕.Neurosci，2001；21：7576-86.

11杜 宣，施畢旻，陳永井，等.硫辛酸對AGEs作用下血管內皮細胞PDL1表達的影響〔J〕.江蘇醫藥，2011；37(3)：249-51.

12Basta G,Schmidt AM,de Caterina R.Advanced glycation end products and vascular inflammation：implications for accelerated atherosclerosis in diabetes〔J〕.Cardiovasc Res，2004；63(4)：582-92.

13Baynes J,Thorpe S.The role of oxidative stress in diabetic complications：a new perspective on an old paradigm〔J〕.Diabetes,1999;48：1-19.

14Nishikawa T,Edelstein D,Du XL,etal.Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage〔J〕.Nature，2000；404：787-90.

15Du XL,Edelstein D,Rossetti L,etal.Hyperglycemia-induced mitochondrial superoxide overproduction activates the hexosamine pathway and induces plasminogen activator inhibitor-I expression by increasing Sp1 glycosylation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000；97:12222-6.

16Craven P,DeRubertis R,Kagan VE,etal.Effects of dietary supplementation with vitamin C or E on albuminuria,glomerular TGFβ and size in diabetes〔J〕.Am Soc Nephrol，1997；8：1405-7.

17Melhem MF,Craven PA,de Rubertis FR.Effects of dietary supplementation of α-lipoic acid on early glomerular injury in diabetes〔J〕.Am Soc Nephrol,2001;12：124-33.

18Bursell S,Clermont A,Aiello LP,etal.High-dose vitamin E supplementation normalizes retinal flow and creatinine clearance in patients with type 1 diabetes〔J〕.Diabetes Care，1999；22：1245-51.

19李雪竹，嚴海東，王 俊，等.銀杏葉提取物、α-硫辛酸對糖尿病大鼠腎組織中糖基化終產物及其受體RAGE表達的影響〔J〕.中國中西醫結合雜志，2011；31(4)：525-31.