四逆湯與福辛普利預(yù)處理對(duì)急性心肌梗死大鼠氧化應(yīng)激的影響

趙小祺 王曉玲 焦 宏 馬建偉 陳立峰 王春光

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 張家口 075000)

氧化應(yīng)激參與急性心肌梗死(AMI)后心室重構(gòu)及充血性心力衰竭的發(fā)生〔1〕。中藥方劑四逆湯有回陽(yáng)救逆之功效，據(jù)《傷寒論》記載，其可上助心陽(yáng)。福辛普利是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)，它具有明顯的保護(hù)缺血心肌的作用〔2〕。本文從抗氧化損傷角度觀(guān)察兩藥預(yù)處理對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性AMI的保護(hù)作用，并探究聯(lián)合用藥的效果。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 健康雄性SD大鼠40只,體重250～280 g,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心提供。

1.2中藥制備及藥品試劑 四逆湯由熟附子、干姜、炙甘草按5∶3∶2比例用水煎制成1 g/ml生藥。福辛普利由上海施貴寶公司生產(chǎn)，規(guī)格：10 mg/片，以0.9%生理鹽水配成所需濃度。血管緊張素(Ang)Ⅱ試劑盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所。

1.3分組與給藥方法 隨機(jī)將40只SD 大鼠分為假手術(shù)組、AMI模型組、四逆湯組、福辛普利組，四逆湯+福辛普利聯(lián)合用藥組，每組8只。四逆湯按5 ml/kg灌胃，福辛普利按20 mg/kg灌胃，聯(lián)合用藥組按四逆湯2.5 ml/kg福辛普利10 mg/kg灌胃，模型組和假手術(shù)組灌服公斤體重相符的生理鹽水，每組灌胃容量均為5 ml/kg，1次/d，連續(xù)3 d。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 于末次給藥后2 h，按文獻(xiàn)〔3〕方法:大鼠麻醉后開(kāi)胸分離心包,在冠狀動(dòng)脈起始點(diǎn)下方2～3 mm 處用0號(hào)絲線(xiàn)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈,假手術(shù)組只穿線(xiàn)繞過(guò)冠狀動(dòng)脈前降支而不結(jié)扎。術(shù)畢迅速將心臟放回胸腔,迅速擠出胸腔內(nèi)氣體,逐層縫合肌肉和皮膚,局部消毒抗菌,整個(gè)開(kāi)胸時(shí)間不超過(guò)30 s。記錄體表心電圖,以Ⅱ?qū)?lián)ST 段弓背向上抬高0.2 mV 以上為造模成功。術(shù)后24 h，除去造模失敗及死亡大鼠，最終獲得完整實(shí)驗(yàn)資料的大鼠33只，假手術(shù)組、模型組和聯(lián)合用藥組各剩余大鼠7只，四逆湯組及福辛普利組各剩余大鼠6只。

1.5指標(biāo)測(cè)定 由腹主動(dòng)脈取血，分別按照AngⅡ放免試劑盒及MDA、SOD、GSH-Px 試劑盒說(shuō)明作相應(yīng)處理，3 000 r/min離心10 min 后,取血清于-20℃以下保存待測(cè)。處死動(dòng)物,取出心臟，用生理鹽水洗凈心腔內(nèi)積血,取非梗死區(qū)心肌組織150～200 mg,盡快放入1 ml生理鹽水中研磨制成勻漿,4℃離心3 000 r/min,15 min,取上清液，-20℃以下保存待測(cè)。采用均相競(jìng)爭(zhēng)放射免疫法測(cè)心肌組織AngⅡ含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1動(dòng)物一般情況 術(shù)前各組大鼠活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，一般狀態(tài)良好。術(shù)后24 h，各組大鼠均出現(xiàn)進(jìn)食量減少，呼吸頻率快，精神狀況差，活動(dòng)明顯減少，除假手術(shù)組外，其他組大鼠均有口鼻及肢體遠(yuǎn)端發(fā)紺；一般狀態(tài)由好到壞排序?yàn)榧偈中g(shù)組、聯(lián)合用藥組、福辛普利組、四逆湯組。

2.2四逆湯與福辛普利對(duì)AMI大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px的影響 與假手術(shù)組比較,模型組血清MDA含量明顯增加,SOD 及GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較,各用藥組均能明顯降低血清MDA含量,并明顯提高血清SOD及GSH-Px活性(P<0.05)；四逆湯組與福辛普利組的作用效果相當(dāng)；而聯(lián)合用藥組的抗氧化作用明顯優(yōu)于單藥(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3四逆湯與福辛普利對(duì)AMI大鼠血清及心肌組織AngⅡ的影響 模型組血清及心肌組織AngⅡ含量均較假手術(shù)組有明顯升高(P<0.05，P<0.01)；四逆湯組與模型組相比,血清AngⅡ含量顯著降低，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)；福辛普利降低AngⅡ的作用明顯大于四逆湯(P<0.05)；從心肌組織AngⅡ含量角度來(lái)看聯(lián)合用藥的效果優(yōu)于四逆湯單藥。見(jiàn)表2。

表1 四逆湯與福辛普利對(duì)AMI大鼠血清MDA,SOD,GSH-Px的影響

表2 四逆湯與福辛普利對(duì)AMI大鼠血清及心肌組織AngⅡ的影響

3 討 論

AMI后由于心肌缺血缺氧，觸發(fā)氧自由基(OFR)的大量產(chǎn)生。OFR是一類(lèi)化學(xué)活性很高的不穩(wěn)定集團(tuán)，其對(duì)細(xì)胞的損傷作用體現(xiàn)在：①直接破壞DNA、RNA，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致代謝紊亂〔4〕。②與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),引起生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化,影響細(xì)胞的信號(hào)傳遞。③攻擊蛋白質(zhì),尤其是具有酶活性的蛋白質(zhì),導(dǎo)致其功能喪失。④激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶、酪氨酸激酶,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。⑤OFR還可造成mtDNA突變，mtDNA突變時(shí)導(dǎo)致了線(xiàn)粒體功能異常,引起氧化磷酸化及ATP生成障礙,能量供應(yīng)不足后，細(xì)胞釋放大量凋亡誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔5〕。⑥OFR還能上調(diào)p53表達(dá)、Bax 蛋白表達(dá)及下調(diào)bcl-2表達(dá)〔6，7〕及直接活化Fas/FasL細(xì)胞凋亡程序〔8〕以及直接激活凋亡蛋白酶caspase而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡〔9〕。另外，高水平的OFR還能損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮下成分暴露于血流，引起血小板聚集、黏附，血栓形成。大量OFR使血管舒張因子合成減少，縮血管因子合成增加，導(dǎo)致血管舒縮功能紊亂，產(chǎn)生強(qiáng)烈收縮，組織供血減少，缺血缺氧進(jìn)一步加重，又觸發(fā)了OFR的產(chǎn)生，形成逐級(jí)放大的惡性循環(huán)。

福辛普利能有效阻斷AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)。而AngⅡ是 AMI后OFR產(chǎn)生增多的重要因素。AMI后，局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活,產(chǎn)生大量 AngⅡ,使左室心肌細(xì)胞加肥加大，每搏輸出量增加；與此同時(shí)，心腔內(nèi)壓力升高,可維持局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活狀態(tài)，產(chǎn)生更多的 AngⅡ，形成惡性循環(huán)。AngⅡ與其受體ATI結(jié)合后激活細(xì)胞磷脂酶C或A2，引起膜磷脂降解，之后再通過(guò)花生四烯酸途徑產(chǎn)生大量的OFR〔10〕。另外，AngⅡ可促進(jìn)交感神經(jīng)末梢釋放兒茶酚胺，使心臟局部的氧化產(chǎn)物增多，導(dǎo)致OFR大量生成〔11〕。基于此,阻斷AngⅡ的ACEI福辛普利就成為拮抗OFR的理想藥物之一。與模型組比較，福辛普利組大鼠血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物 MDA明顯降低就說(shuō)明了這一點(diǎn)。此外，本研究結(jié)果說(shuō)明機(jī)體對(duì)OFR的清除能力增強(qiáng)，這樣福辛普利的抗氧化作用就得到了雙重保障。

四逆湯是張仲景所著《傷寒論》中回陽(yáng)救逆的代表方。組成四逆湯的單味藥附子和甘草均對(duì)LPO有顯著抑制作用,根據(jù)抑制率大小依次為附子>甘草>干姜,但拆方后沒(méi)有任何一個(gè)單味藥可與全方的效應(yīng)相比。另有研究證實(shí)，甘草的主要成分甘草甜素對(duì)OFR有顯著的淬滅效應(yīng)〔12〕。本文中四逆湯降低 AMI大鼠血清中MDA并升高SOD、GSH-Px活性也證明了這一點(diǎn)。此外，本研究中結(jié)果證實(shí)，四逆湯雖有降低AngⅡ的作用，但其效果遠(yuǎn)較福辛普利弱，在不排除現(xiàn)有樣本數(shù)目較小有造成的抽樣偏差基礎(chǔ)上，暫不考慮四逆湯對(duì)腎素-血管緊張素系統(tǒng)有明顯抑制作用。因此，四逆湯可能并不通過(guò)此途徑來(lái)保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化損傷。至少其主要的抗氧化機(jī)制不是通過(guò)抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，而是存在其他更主要的機(jī)制，有待于進(jìn)一步探究。

在拮抗OFR方面，四逆湯單用與福辛普利單用的效果相當(dāng)，而二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其降低MDA含量、增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性的作用明顯強(qiáng)于單藥。其原因可能是兩藥的達(dá)到拮抗OFR效應(yīng)的主要途徑和機(jī)制不同，因此，半劑量聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，兩藥起到了相輔相成的作用，使各自藥效放大，這一點(diǎn)類(lèi)似于中藥方劑中配伍的理念。

本研究證明中藥四逆湯與西藥福辛普利聯(lián)用，其抗氧化作用明顯。但其臨床療效還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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