煤工肺塵埃沉著病患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平與肺功能關(guān)系

李 超 袁寶軍 鄒吉敏 王冬梅 張淑青

(開灤總醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000)

煤工肺塵埃沉著病(CWP)是一種慢性彌漫性肺間質(zhì)纖維化疾病，以肺功能損傷為主。目前，肺功能測定依然是觀察肺塵埃沉著病病情及判斷預(yù)后的主要指標(biāo)。研究認(rèn)為，矽肺患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群對肺功能具有一定影響〔1〕。細(xì)胞免疫損傷可導(dǎo)致肺功能改變〔2〕。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)是一群表型和功能特異的T淋巴細(xì)胞，具有獨特免疫抑制調(diào)節(jié)功能，它可通過對早期炎性細(xì)胞的抑制來調(diào)節(jié)矽塵引發(fā)的炎癥〔3〕。本研究探討CWP患者外周血CD4+CD25+Treg水平及CD4+CD25+Treg/CD4+比值改變與肺功能關(guān)系。

1 對象與方法

1.1對象 2010～2011年開灤職業(yè)病防治院體格檢查的在職和退休工人及住院的CWP患者145例(一期137例，二期8例)，年齡51～84〔平均(65.12±9.12)〕歲，接塵工齡10～38〔平均(29.46±6.51)〕年。均經(jīng)開灤職業(yè)病防治院按照GBZ70-2009《塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)》確診CWP。對照組為具有與CWP組相同接塵條件的健康井下接塵礦工85例，年齡52～79〔平均(65.50±6.78)〕歲，接塵工齡10～37〔平均(28.40±4.55)〕年。兩組均為男性，且無肝臟疾病、腎臟疾病、心腦血管疾病、糖尿病，也無肺部并發(fā)癥、近期肺部感染史及免疫系統(tǒng)疾病。兩組年齡及接塵年限差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2試劑和儀器 主要試劑：多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)標(biāo)記的抗CD45單克隆抗體，異硫氰酸熒光素(FITC) 標(biāo)記的抗CD4單克隆抗體，藻紅蛋白(PE) 標(biāo)記的抗CD25單克隆抗體，同型對照IgG1 FITC /IgG2a PE雙色單克隆抗體，以上試劑均購自美國 BD Biosciences。儀器：美國BD公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀，德國耶格的PTF肺功能機(jī)。

1.3標(biāo)本采集 所有研究對象均采集早晨空腹靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸K2抗凝管保存，入院患者于治療前采集，采集后6 h內(nèi)處理。

1.4檢測方法 取2支流式試管，各取100 μl抗凝全血，分別加入熒光標(biāo)記CD4 FITC/CD25PE/CD45 PerCP， IgG1 FITC/IgG2a PE/CD45 PerCP單克隆抗體各20 μl，室溫避光孵育20 min，加紅細(xì)胞裂解液2 ml，渦旋混勻，避光10 min，300 r/min離心5 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液清洗2次，加入含1%多聚甲醛的PBS 0.5 ml。置流式細(xì)胞儀按常規(guī)進(jìn)行分析。以相應(yīng)熒光標(biāo)記的同型對照染色細(xì)胞為陰性對照，同時調(diào)節(jié)電壓，閾值，各通道之間的熒光補(bǔ)償，以CD45設(shè)定淋巴細(xì)胞門，測定CD4+CD25+和CD4+細(xì)胞比例，每個樣品收集10 000個細(xì)胞。用cellquest軟件分析結(jié)果。

1.5觀察指標(biāo) 用力肺活量(FVC)、1 s用力呼氣量(FEV1)、用力呼氣1 s率(FEV1/FVC)、最大呼氣中期流速(MMEF75/25) 測定使用PTF肺功能機(jī)，按常規(guī)操作方法，依照儀器說明書要求有專人嚴(yán)格操作。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗和Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血CD4+CD25+Treg、CD4+T細(xì)胞及其比值水平變化 與對照組比較，CWP組CD4+CD25+Treg、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+CD25+/CD4+比值明顯升高(P均<0.01)，見表1。

表1 兩外周血CD4+CD25+Treg、CD4+T細(xì)胞及其比值水平變化

2.2兩組肺功能四項指標(biāo)水平變化 與對照組比較，CWP組FVC、FEV1、FEV1/FVC、MMEF75/25均明顯降低(P均<0.05)，見表2。

表2 兩組肺功能四項指標(biāo)實測值占預(yù)計值的百分比

2.3外周血CD4+CD25+Treg 、CD4+T細(xì)胞及其比值與肺功能四項指標(biāo)的相關(guān)性分析 CWP組患者外周血CD4+CD25+Treg與CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.627，P<0.01)，CD4+CD25+/CD4+與FVC(%)呈正相關(guān)(r=0.293，P<0.05)；對照組CD4+CD25+Treg與CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.590，P<0.01)，CD4+CD25+/CD4+與MMEF75/25呈正相關(guān)(r=0.430，P<0.05)；其他指標(biāo)間無相關(guān)性。

3 討 論

在矽肺大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著纖維化的形成逐步上升，CD4+CD25highT細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)第28天達(dá)到高峰，細(xì)胞免疫功能嚴(yán)重紊亂，矽肺大鼠體內(nèi)免疫耐受失衡〔4〕。博來霉素誘導(dǎo)的纖維化動物模型研究中也發(fā)現(xiàn)，肺組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg顯著升高，認(rèn)為肺纖維化中CD4+CD25+Treg免疫抑制功能增強(qiáng)，導(dǎo)致小鼠肺內(nèi)微環(huán)境及免疫系統(tǒng)改變〔5〕。本實驗提示隨著纖維化的形成，CWP患者CD4+CD25+Treg免疫抑制能力可能增強(qiáng)，免疫調(diào)節(jié)活性增加，在急性肺損傷的病理發(fā)展過程中，CD4+CD25+Treg發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)功能〔6〕。

本研究結(jié)果提示 CD4+CD25+Treg與輔助性T細(xì)胞比例的改變可打破免疫系統(tǒng)的免疫耐受，為促進(jìn)肺纖維化提供了一個免疫系統(tǒng)過度激活的環(huán)境〔7〕。其作用機(jī)制可能是，CD4+CD25+Treg抑制同種異體抗原刺激的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖所致〔8〕。表明CD4+CD25+Treg和CD4+T細(xì)胞在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中相互作用，發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)功能，CD4+CD25+/CD4+比值改變可能影響體內(nèi)細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。

肺功能測定是評價早期CWP患者肺功能損害和代償功能分級的基本依據(jù)，其中FVC、FEV1、FEV1/FVC是反映大氣道功能的指標(biāo)，MMEF75/25是反映小氣道功能的指標(biāo)，肺纖維化可使肺泡擴(kuò)張的彈性阻力增加，引起限制性通氣不足，使通氣換氣功能受到嚴(yán)重?fù)p害〔9〕。此次研究結(jié)果表明隨著CWP病情的進(jìn)展，肺部的炎癥水腫和纖維化進(jìn)一步加重，肺實質(zhì)的炎性細(xì)胞滲出和結(jié)締組織增生使肺組織有效腔體較少，大小氣道腔變窄或阻塞造成不同程度的損傷，CWP患者肺功能明顯低下〔10〕。

另外，在對矽肺患者外周血T淋巴細(xì)胞與肺功能相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細(xì)胞可能具有加重小氣道通氣功能障礙的作用〔1〕，而肺塵埃沉著病患者外周血CD3+改變可影響肺彌散功能〔2〕。本研究認(rèn)為CD4+CD25+/CD4+比值變化可間接反映大小氣道通氣能力，二者比值的增高可緩解炎癥反應(yīng)造成的通氣能力障礙。

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