氨基胍對博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預作用及機制

張可可 連曉怡 鄭金旭 端禮榮

(江蘇大學附屬醫院，江蘇 鎮江 212001)

特發性纖維化(IPF)是特發性間質性肺炎(IIP)中最多見的一種疾病。2011年制定的IPF循證醫學指南將其定義為：IPF是一種慢性纖維化性間質性肺炎，組織學和(或)胸部高分辨CT特征性表現為普通性間質性肺炎(UIP)，病因不明〔1〕。目前臨床上尚無對IPF有明確療效的治療藥物。研究顯示一氧化氮(NO)是一種有活性的小分子，參與機體多種生理代謝過程〔2〕。陳磊等〔3〕研究報道氨基胍(AG)作為誘導性NO合酶(iNOS)抑制劑的干預作用可以下調熱休克蛋白47等纖維化因子的表達。本實驗對博萊霉素(BLM)誘導的大鼠纖維化模型進行AG和激素干預，探討其在肺纖維化中的作用與機制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級雄性SD大鼠116只，體重(201±18)g，由江蘇大學實驗動物中心提供。主要儀器和試劑為BLM(日本化藥株式會社)；氨基胍(SIGMA公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(上海通用藥業)；羥脯氨酸測試盒及NO測試盒(南京建成生物公司)；ABI7500熒光定量分析儀；Takara SYBR Premix Ex Tag.Eppendorf離心機。

1.2動物分組及模型建立 將116只SD大鼠隨機分成5組?？瞻讓φ战M20只，模型組24只，AG組24只，激素組24只，AG+激素組24只。大鼠稱重，用10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于鼠板上，剪開頸部皮膚，鈍性分離唾液腺，暴露氣管，用注射器注入BLM溶液(5 mg/kg)，然后迅速直立并旋轉鼠板。空白對照組操作同上，氣管內注射生理鹽水0.3 ml。建立肺纖維化模型后第2天，AG組每天根據體重以80 mg/kg AG灌胃，激素組每天根據體重以3 mg/kg地塞米松腹腔注射，AG+激素組每天根據體重給予80 mg/kg 灌胃及地塞米松3 mg/kg腹腔注射?？瞻讓φ战M及模型組每天注射生理鹽水0.2 ml。分別在7，14，21，28 d每組隨機處死5只。

1.3標本采集 在處死老鼠前，用10%水合氯醛麻醉標本。切開頸部暴露氣管，插入靜脈留置針后，冰生理鹽水10 ml，以3、3、4 ml分次注入，回收率超過90%為支氣管肺泡灌洗液(BALF)，冰上放置備用。腹主動脈放血法處死老鼠，打開胸腔，分離左右支氣管并結扎右側，左側經氣管注入10%甲醛5 ml左右，剪斷左支氣管后投入甲醛固定液。右側肺葉，簡單剪成小組織塊后分別置于凍存管放入液氮保存。

1.4研究指標檢測

1.4.1羥脯氨酸測定 按照試劑盒上的要求進行，大概步驟如下：精確稱取右肺組織60～80 mg，加入裂解液后，沸水浴20 min，利用指示劑和pH6.0～6.8加活性碳后離心，取澄清上液1 ml ，加試劑后混勻，再水浴，離心，取上清在550 nm處，測各管吸光度。

1.4.2BALF中NO測定 回收BALF低溫離心后，留上清液置于-70℃保存。用硝酸還原法測NO含量，大致步驟如下：按照試劑盒說明，配置混合試劑，顯色劑和標準品應用液。在各管中加入相應試劑后，37℃水浴，室溫靜置，離心，精確取上清加顯色劑。在550 nm光徑處測各管吸光度。

1.4.3RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA的表達 取70～90 mg低溫凍存肺組織，用trizol法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。以總RNA為模板，應用Thermo公司逆轉錄試劑盒進行反應，反應條件25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min。取2 μl合成cDNA進行實時PCR反應。由上海生工設計轉移生長因子β1的上游引物：5′-aaggtaacgccaggaattgtt-3′，下游引物：5′-geaacaacgcaatctatgaca-3′。β-actin 上游引物：5′-cccatctatgagggt tacgc-3′，下游引物：5′-tttaatgtcacgcacgatttc -3′。反應條件為預變性95℃30 s 1個循環，95℃3 s，58℃30 s 40個循環。反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線。利用軟件計算mRNA相對表達量，β-actin為內參照。

1.5統計處理 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1一般情況觀察 在觀察期內BLM組大鼠逐漸出現進食減少，毛發失去光澤，肢端發紺，呼吸急促等現象。于第8、13、20天各死亡1只。AG組在早期7 d同BLM組比較沒有明顯差異，14 d后體重增長好于BLM組。于第4天死亡1只，第19天死亡2只。激素組大鼠在干預后體重下降明顯，早期就出現毛發脫落，腹瀉，便血等癥狀。于第12、13、14天各死亡1只，第19天死亡3只，第21天死亡2只。AG+激素組在后期也出現類似激素組的體征。于第17，18天各死亡1只，第20天死亡2只，第22天死亡3只。第28天觀察時間點由于激素組和AG+激素組大鼠存活只數低于5，故不納入統計分析。

2.2BALF中NO的含量變化 7、14 d所有治療組的BALF中NO的含量相比模型組均呈下降趨勢(P<0.05)。在21 d及28 d差別無顯著性(P>0.05)。在14 d各組NO均達到高峰，隨后出現下降趨勢(表1)。

表1 各組肺泡灌洗液中的NO的含量

2.3肺組織羥脯氨酸含量變化 14、21 d所有治療組與模型組比較，羥脯氨酸含量下降趨勢明顯(P<0.05)。28 d AG組和模型組沒有統計學差異(P>0.05)(表2)。

2.4各組TGF-β1 mRNA的表達變化 模型組及所有治療組的TGF-β1 mRNA的表達均高于對照組。7、14 d各治療組TGF-β1 mRNA的表達均低于模型組(P<0.05)。21、28 d模型和治療組的TGF-β1的表達均呈現下降趨勢，AG+激素組和模型組有顯著差異(P<0.05)(表3)。

表2 各組大鼠肺組織羥脯氨酸含量

表3 各組大鼠肺組織TGF-β1 mRNA的相對表達量

3 討 論

目前雖然近年認為IPF發病與肺泡上皮細胞損傷及上皮-間質轉化(EMT)和異常修復有關〔4～6〕。但具體機制依然不完全明確。多數急性加重的IPF患者的治療上主要以糖皮質激素和抗纖維化藥物為主，該疾病的自然病程變異很大〔7,8〕。由于免疫抑制劑使用的副作用，其在臨床的使用受到了一定程度的限制。

AG是一種肼復合物，具有選擇性抑制誘導性iNOS的作用〔9〕。由iNOS產生的NO在BLM誘導的肺泡炎中發揮重要作用。炎癥因素刺激下，肺泡巨噬細胞，肺泡Ⅱ型上皮細胞及肺成纖維細胞內誘導性iNOS表達增強，NO產量增加〔10〕。

糖皮質激素通過抑制炎癥介質的表達和纖維細胞的增生具有抗炎和抗纖維化的作用。但是激素治療的副作用明顯，易發生免疫抑制，增加樣本的死亡率。AG長期應用的毒副作用是否優于免疫抑制劑和糖皮質激素，目前還不明確。高濃度的NO作為活性氮氧中間產物參與介導應激反應，造成組織和細胞損傷〔11〕。研究報道AG聯合厄多司坦對BLM誘導的鼠肺纖維化有治療作用且優于傳統激素治療組〔12，13〕。本實驗結果尚沒有體現此觀點，推測和AG及激素使用的劑量有關。羥脯氨酸為膠原纖維所特有，對羥脯氨酸的測定可以反映臟器纖維化的程度。NO可以促進肺成纖維細胞的增殖，該細胞是肺纖維化的重要因素。本實驗結果提示抑制NO的生成可以減輕肺纖維化的程度。

TGF-β1是與臟器纖維化相關的重要因子〔14～16〕，也是機體維持正常免疫功能不可缺少的因子，只有TGF-β1過度表達引起其他細胞因子高表達才會引起纖維化的發生〔17〕。本文結果說明AG可以在肺泡炎癥期及炎癥纖維化交替轉化期下調肺TGF-β1 mRNA的表達，但該作用在纖維化發展中后期是否仍然有意義，還需進一步的研究來闡明。

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