冬凌草甲素通過激活ATM蛋白誘導人肝癌HepG2 細胞G2/M細胞周期阻滯

王海艷 朱志兵

( 德州市人民醫院,山東 德州 253000)

冬凌草甲素(oridonin)，別名冬凌草素、延命草寧，是冬凌草的主要有效成分，為四環二萜類化合物。研究表明，冬凌草甲素對多種腫瘤細胞有顯著的抑制或殺傷作用，具有明顯的細胞毒作用和較強的抗腫瘤活性〔1〕，冬凌草甲素對 20 余種人癌細胞株生長均有明顯的直接抑制作用〔2〕，對多種腫瘤細胞如白血病細胞 NB4〔3〕、肝癌細胞 HepG2〔4〕、膀胱癌細胞MB49〔5〕、黑色素瘤細胞 A357-S2〔6〕等的增殖具有明顯抑制作用。 我們前期工作表明冬凌草甲素對人肝癌HepG2 細胞具有生長抑制和誘導凋亡作用〔4〕。本課題在前期研究基礎觀察不同濃度的冬凌草甲素誘導肝癌HepG2細胞細胞周期阻滯和作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 冬凌草甲素購自上海詩丹德生物技術有限公司(純度≥98%)，用DMSO 溶解(濃度≤0.1%) ；DMEM 培養基(美國Gibco公司)；小牛血清(美國Gibco公司)；H2AX(1∶100；Cell Signalling)，γ-H2AX(1∶100；Cell Signalling)，Phos-S1981ATM(1∶100；Cell Signalling)，anti-p53(FL-353 at 1 μg/ml,Santa Cruz); anti-phospho-p53(S15) (1∶1 000,Cell Signaling)；anti-ATM (1∶500，Rockland), anti-phosph-CHK2 (T68) (1∶500，Cell Signalling), anti-CHK2 (1∶1 000，Cell Signalling),辣根過氧化酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶1 000，SantaCruz Biotechnology 公司)； β-actin(美國 Santa Cruz公司)； RNA酶、PI染液(美國Sigma 公司)。

1.2細胞系 人肝癌HepG2細胞株購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。細胞接種于含10%小牛血清的DMEM 培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，常規消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3Western印跡檢測 p53、Cyclin A、 H2AX蛋白表達 不同濃度的冬凌草甲素(0、16、32、64 μmol/L)處理HepG2 細胞48 h 后， 收集2×106/ml細胞，總蛋白的提取用賽百勝公司的 Protein Extraction solution，并且用Bradford方法定量蛋白質。上樣前取 20 μg 等量蛋白質加上等體積 2×上樣緩沖液，于 95℃變性10 min后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結束后，恒流260 mA，90 min 將蛋白質轉到 PVDF 膜上，然后用含 5% BSA 的 TTBS 室溫封閉 1 h，進行一抗孵育，將一抗按照推薦濃度溶于封閉液中,與對應膜共同封閉在塑料袋中, 4℃下過夜。一抗孵育結束后，用TBST(TBS+0.1% Tween20)漂洗膜4次，每次15 min。再使用對應的二抗孵育,按照相應比例稀釋(1∶1 000),室溫輕搖1 h，二抗孵育結束后，再用TBST漂洗膜4次，每次15 min。最后使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光顯色法對膜進行顯色曝光。

1.4流式細胞儀檢測細胞周期改變 不同濃度(16、32、64 μmol/L)冬凌草甲素處理細胞24 h后收集細胞,冰PBS洗2次,用70%冰乙醇4℃固定1 h,冰PBS洗2次,用3 ml PBS重懸細胞加入RNA酶至終濃度為100 μg/L,37℃水浴30 min，加入PI至終濃度為50 μg/L,4℃避光30 min， 流式細胞儀上機，488 nm 波長激發檢測細胞周期并分析。重復試驗3次。

2 結 果

2.1Western印跡結果 不同濃度的冬凌草甲素處理HepG2 細胞48 h后，Western印跡結果表明，隨著濃度的增加，Phos-S1981ATM、anti-phosph-CHK2 (T68)、anti-phosph-CHK2(T68)、Phos-p53和γ-H2AX蛋白水平呈逐漸增加趨勢(見圖1)。

圖1 Western 印跡結果

2.2流式細胞儀檢測細胞周期結果 不同濃度的冬凌草甲素(0、 16、32、64 μmol/L)處理HepG2 細胞48 h后，G2/M 期細胞比例分別為16.03%、26.01%和46.95%,呈逐漸增多趨勢,而G0/G1期細胞呈相對減少趨勢。16、32和64 μmol/L 冬凌草甲素組G2/M 期細胞比例與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05) 。見表1。

表1 不同濃度冬凌草甲素對HepG2 細胞周期的影響±s,%)

圖2 細胞周期流式圖

3 討 論

與其他一些常見的惡性腫瘤相比，肝癌的治療效果很差。外科手術仍然是最有可能為肝癌帶來治愈希望的治療手段。但是只有外科手術是不夠的，綜合治療必不可少，尋找肝癌治療的途徑勢在必行。我國對冬凌草及其有效成分的藥理研究始于20 世紀70 年代后期。此后，主要集中在對冬凌草甲素抗腫瘤作用及其機制的研究上。既往多項體外試驗表明,冬凌草甲素對多種人癌細胞株有生長抑制效應〔7,8〕。

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞的增生、分裂、變形、凋亡和壞死等生理或病理過程都發生在它所處的細胞周期的某一時相；若細胞周期的某一時相出現異常，細胞將進入與之相關的病理過程〔9〕。細胞周期受體內外多種因子、多層次調控，而細胞周期調控與腫瘤的發生、發展關系密切。幾乎所有的腫瘤都有一個共同的特征： 細胞周期調控機制破壞,導致細胞失控性生長。G/M期DNA損傷檢驗點是細胞周期運行至有絲分裂前細胞自我修復的最后時機，本實驗研究結果顯示，冬凌草甲素使細胞阻滯于G2/M 期,通過有絲分裂擾亂細胞進程、抑制細胞生長。

細胞DNA在細胞周期運行過程中不斷受到外源性和內源性因素的損傷。DNA損傷后激活細胞周期損傷檢驗點，啟動修復機制，在進入有絲分裂之前修復損傷的DNA，確保轉錄基因組的完整性，如果修復失敗或者損傷因素積累，損傷的基因會隨著細胞分裂遺傳給子代細胞，就可能導致無法控制的細胞增殖，最終導致癌變〔10〕。細胞周期中主要的細胞DNA損傷檢驗點是細胞進入有絲分裂前修復DNA損傷的最后時機〔11〕，共濟失調-毛細血管擴張突變基因(ATM)和Rad-3相關蛋白(ATM and Rad-3 related,ATR)激酶可以感知DNA損傷,并將DNA損傷信號傳導到下游靶蛋白,啟動應激系統,產生細胞周期阻滯，從而完成DNA修復或啟動細胞凋亡程序〔12～14〕，因此ATM和ATR對維持細胞基因組的穩定和防止腫瘤的發生至關重要。

本研究Western印跡結果表明，隨著冬凌草甲素濃度的增加，Phos-S1981ATM、anti-phosph-CHK2 (T68)、anti-phosph-CHK2 (T68)、Phos- p53和γ-H2AX蛋白水平呈逐漸增加趨勢。由以上結果可以分析，冬凌草甲素通過激活ATM蛋白細胞信號通路，引起G2/M期阻滯而為損傷DNA修復提供時間。細胞內激活各種檢驗點相關蛋白,觸發檢驗點信號傳導級聯反應，激活由ATM R調節的網絡系統，在相關調節蛋白作用下，感應蛋白將DNA損傷信號傳遞至信號傳導蛋白，作用于相應的效應蛋白,通過“ATM-p53-CHK2”通路, 引起細胞周期G 期阻滯，最終導致細胞周期阻滯、細胞凋亡、DNA修復，損傷誘導的轉錄程序激活。

本研究結果表明冬凌草甲素能夠通過激活ATM細胞信號通路、誘導人肝癌HepG2 細胞發生阻滯，發揮抑制HepG2細胞生長的作用，從而調整細胞增殖與凋亡間的平衡。本試驗結果為研究冬凌草甲素抗腫瘤作用分子藥理機制是否與分子靶標有關提供了一定的試驗依據。

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