眼針對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦皮層組織FADD表達的影響

趙丹玉 王 哲 曹 陽 王德山

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院，遼寧 沈陽 110847)

眼針療法為我校著名老中醫彭靜山教授所創，是一種微針療法。百余萬病例實踐證明，眼針對于急性腦中風以及頑固性疼痛等優勢病種療效顯著，但是其機制尚不清楚。本課題建立大鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)模型，研究眼針對于CIRI大鼠損傷側大腦皮層組織Fas相關凋亡結構域蛋白(FADD)表達的影響，研究眼針對于CIRI的作用機制,為“眼絡于腦”的中醫理論假說提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SPF級Wistar雄性大鼠，體重280～320 g。購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物許可號：SCXK(滬)2008-0016。RNAiso Reagent和RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司；SABC免疫組織化學試劑盒、一抗FADD、GAPDH多克隆抗體及山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2動物分組與模型復制 大鼠以隨機數字法分為正常組、假手術組、模型組和眼針組，剔除造模不成功以及死亡鼠，最終每組保證至少18只。正常組：常規喂養無任何施加因素。模型復制與成模標準：采用改良的線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血(MACO)再灌注動物模型(右側栓塞)〔1〕。造模后參照Longa 5分制評分標準進行神經功能缺損評分〔2〕。以神經功能缺損評分≥1分者視為造模成功。將造模成功的大鼠再隨機分為模型組和眼針組。假手術組：術式與操作基本過程同模型組和眼針組，只是不進行大腦中動脈栓塞。模型組常規喂養，不給予任何刺激。眼針組在缺血再灌注即刻、造模術后12 h及造模術后24 h即處死前各針刺1次。

1.3眼針取穴與刺法 取穴參照人體取穴定位法分別?。荷辖箙^、下焦區、肝區、腎區〔3〕；刺法：用35 mm×25 mm毫針在相應眼穴區距眶內緣2 mm處，平刺，由該區始點向該區終點方向，刺入0.3 cm，行捻轉手法，留針30 min，15 min行針1次，時間1 min。

1.4RT-PCR檢測FADD mRNA表達 于造模術后24 h每組各取6只鼠，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,迅速斷頭取腦，分離右側皮層組織。總RNA提取用RNAiso Reagent試劑，按說明操作。提取后的總RNA以分光光度法鑒定其純度。用RT-PCR試劑盒進行逆轉錄及聚合酶鏈反應。FADD的引物序列為：正義鏈CTGGGCAGACACGACCTAC，反義鏈TCCCTTACCCGATCACTCA，長度：221 bp，退火溫度：65℃；β-actin的引物序列為：正義鏈GCACCAAGTGCCACAAAGGAA，反義鏈TGCGAAGCTGTAAAGGTGCCT，長度：592 bp，退火溫度：65℃。RT-PCR反應產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，拍照，凝膠掃描系統進行吸光度積分分析(IOD)，以FADD的RT-PCR產物IOD和內參β-actin的RT-PCR產物的IOD比值顯示FADD mRNA的表達變化。

1.5免疫組化檢測FADD蛋白表達 于造模術后24 h每組各取6只鼠，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，先后用生理鹽水及4 %多聚甲醛心內灌流，迅速斷頭取腦，取額極至中腦間腦組織冠狀面置于4%多聚甲醛中后固定24 h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，每隔100 μm連續作5 μm厚腦冠狀面石蠟切片。石蠟切片進行免疫組化染色，具體步驟按即用型SABC免疫組織化學試劑盒說明書操作。最后于高倍物鏡下觀察、照相及圖像處理分析，測定平均光密度值(MOD)。每張切片測定6個視野取平均值作為測定值。

1.6Western印跡檢測FADD蛋白表達 于造模術后24 h每組各取6只鼠，麻醉后,迅速斷頭取腦，于無菌條件下冰上分離右側皮層組織，加入相應體積的裂解液后勻漿， 12 000 r/min離心30 min，收集上清，檢測各樣本蛋白濃度。將樣品和蛋白分子量標準分別加入膠孔內開始電泳。電泳完畢，半干式轉印槽印跡約1.5 h，封閉，37℃，2 h，加入適當稀釋的一抗(FADD、GAPDH均以1∶100用封閉液稀釋)，4℃過夜。TBST沖洗后加入1∶2 000稀釋的酶標二抗，37℃，45 min。DAB顯色。掃描硝酸纖維素膜上的條帶，凝膠掃描系統進行吸光度積分分析(IOD)，以GAPDH作為內參，各組IKKβ、NF-κB的蛋白表達強度IOD和內參GAPDH的蛋白表達強度IOD比值顯示各組IKKβ、NF-κB的蛋白表達變化

2 結 果

2.1眼針對CIRI 模型大鼠一般狀態影響 假手術組大鼠手術完成動物蘇醒后，無神經功能缺損體征出現，根據神經功能缺損評分標準進行評分，平均為0分。造模成功的大鼠蘇醒后出現明顯的不能完全伸展對側前爪、向對側轉圈及向對側傾倒等神經功能缺損癥狀。術后24 h,模型組動物神經功能缺損癥狀隨時間延長逐漸加重，神經功能缺損評分具有明顯上升趨勢；眼針組神經功能缺損癥狀加重不明顯，顯示出眼針治療的腦保護作用。

2.2眼針對CIRI模型大鼠大腦皮層組織FADD mRNA 表達影響 通過對電泳的結果以及凝膠掃描系統進行吸光度積分分析，RT-PCR檢測結果如圖1、圖2、表1所示，正常組及假手術組大鼠右側大腦皮層組織FADD的 mRNA 均表達較少，二者之間沒有顯著差異(P>0.05)；同正常組與假手術組相比較，CIRI模型組FADD呈現明顯高表達(P<0.01)；而眼針組的表達較模型組明顯下降(P<0.01)。

1、2、3泳道：正常組；4、5、6泳道：假手術組；7、8、9泳道：模型組；10、11、12泳道：眼針組

1、2、3泳道：正常組；4、5、6泳道：假手術組；7、8、9泳道：模型組；10、11、12泳道：眼針組

表1 眼針對CIRI模型大鼠缺血側大腦皮層組織FADD表達的影響

2.3眼針對CIRI模型大鼠大腦皮層組織FADD蛋白表達影響

2.3.1免疫組化結果 以圖3、表1所示，染色結果可見，正常組及假手術組大鼠右側大腦皮層組織鮮見的FADD陽性細胞表達。CIRI模型組可見較多的FADD陽性細胞，胞漿著色，與正常組和假手術組比較有顯著性差異(P<0.01)；眼針組陽性細胞數量顯著減少，同模型組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3.2Western印跡結果 通過對免疫印跡的結果進行吸光度積分分析，如圖4、圖5及表1所示，正常組及假手術組大鼠右側大腦皮層組織FADD蛋白均表達較少，二者之間沒有顯著差異(P>0.05)；同正常組與假手術組相比較，CIRI模型組FADD呈現明顯高表達(P<0.01)；而眼針組表達較模型組明顯下降(P<0.01)。

圖3 眼針對CIRI模型大鼠缺血側大腦皮層組織FADD蛋白表達影響(IHC，DAB染色，×400)

1：正常組；2：假手術組；3：模型組；4：眼針組

1：正常組；2：假手術組；3：模型組；4：眼針組

3 討 論

CIRI在腦血管病的發病及相應的治療過程中起重要作用。近年來研究發現CIRI與細胞凋亡有著密切的關系〔3〕，凋亡機制參與CIRI已成為臨床研究的熱點。凋亡主要發生在半暗帶區，即介于缺血壞死灶和正常組織之間的區域，半暗帶凋亡的發生參與梗死灶的發展,最終決定腦梗死的體積〔4，5〕。改善半暗帶區的細胞凋亡是防治CIRI重點要解決的問題。

神經元凋亡是一種由基因控制的細胞主動死亡過程，在不同的刺激信號影響下，涉及多個基因表達及相互作用的復雜過程〔6〕。死亡受體通路是導致凋亡的重要信號通路。死亡受體通路包括Fasl/Fas和TNFα/TNFR1兩條通路。FADD是死亡信號轉導通路中的一個重要的連接蛋白。FADD是存在于胞漿中的一種含死亡結構域(DD)的連接蛋白。分子中包含兩個結構域，即C末端的DD和N末端的死亡效應結構域(DED)。DD結構域是FADD與其上游分子Fas、TRADD(TNFR1的下游分子)結合的部位；DED結構域是其誘導凋亡的活性部位，而且已證明FADD的DED寡聚化作用,足以引起凋亡的發生。由此可見，FADD是Fas1/Fas和TNFα/TNFR1兩條信號轉導通路共同的連接分子，在凋亡的發生過程中處于中心環節。

彭靜山教授所創的眼針療法根據中醫目診的基本理論“八廓學說”，用后天八卦將眼睛分為八區，并根據《證治準繩》《目門》卷七中引用華佗的話將眼周分為十三穴，根據各區內白睛脈絡的變化，配以臟腑，用以“觀眼識病”并根據具體病情辯證取穴。中風之發生，病機較復雜.歸納起來不外虛、火、風、痰、氣、血六端，其中以肝腎陰虛為其根本，此六端在一定條件下，互相影響，相互作用而突然發病。心、肝、腎三臟陰陽失調是中風重要病機，肝腎陰虛，肝陽偏亢。因此眼針取穴取肝區平肝潛陽，調暢氣機，調理藏血；取腎區以滋陰補腎，填精益髓，從而使肝血腎精充盛。

本課題前期研究表明,眼針可以有效抑制缺血半暗區細胞凋亡，改善局部缺血缺氧從而改善缺血半暗區微循環，對腦缺血再灌注損傷起保護作用〔7〕。本實驗結果表明，同正常組及假手術組相比較，模型組大鼠神經功能缺損評分明顯增高，結合本課題其他檢測指標〔8，9〕，說明CIRI造模成功。模型組大鼠缺血側大腦皮層組織中FADD的mRNA及蛋白表達均明顯高于正常組及假手術組，提示CIRI狀態下，FADD表達顯著增強，同以往的研究結果一致〔10〕。眼針治療后大鼠神經功能缺損狀況顯著改善，FADD基因及蛋白表達明顯下降。作為死亡受體通路的中心物質表達降低，提示死亡受體通路極可能被抑制，從而半暗帶區細胞的凋亡受到抑制，起到防止梗死灶迅速擴大，保護腦組織的作用，這可能是眼針抑制CIRI半暗帶區的凋亡的主要機制之一。FADD表達的下調是否為眼針刺激對于整個信號通路的調節靶點，還待今后作進一步的研究。

4 參考文獻

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