重組chemerin蛋白對3T3-L1脂肪細胞visfatin、MCP-1基因表達的影響

焦 誼 常 曦 王麗鳳 李俊紅 關亞群

(新疆醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

近幾年的研究表明，脂肪源性細胞因子參與肥胖相關的胰島素抵抗(IR)、2 型糖尿病(T2DM)等病理生理過程。脂肪細胞分泌的多種細胞因子如chemerin、內脂素(visfatin)及單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等均參與機體一些重要機能的調節〔1～3〕。脂肪細胞不僅參與能量代謝，還參與了炎癥反應，MCP-1 是單核細胞和T淋巴細胞的主要趨化因子。有研究顯示MCP-1 與各種肥胖相關性疾病存在明顯相關，因此，MCP-1 可能成為肥胖相關性疾病十分有用的治療靶點〔4，5〕。筆者在前期研究中發現，chemerin表達水平隨著脂肪細胞分化成熟而顯著上調〔6〕,但其如何影響糖、脂代謝以及參與肥胖誘導的IR的確切機制目前尚不清楚。因此，本研究采用不同時間、劑量的chemerin蛋白干預成熟的3T3-L1脂肪細胞，觀察該蛋白對MCP-1、visfatin基因表達的影響，為深入研究chemerin蛋白在肥胖、糖尿病等疾病發病中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 3T3-L1前脂肪細胞株購自中國科學院上海細胞庫，DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素購自Gibico公司，胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine IBMX)、地塞米松購自Sigma公司，重組小鼠chemerin蛋白購自R&D公司，逆轉錄試劑盒購自Promega公司， PCR擴增試劑盒等購自上海生工生物有限公司。

1.2方法

1.2.1脂肪細胞的培養及誘導分化 將3T3-L1前脂肪細胞接種于6孔培養板中，用含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養液，在37℃ 5% CO2的培養箱中培養，每2 d換液1次，待細胞接觸抑制2 d后開始誘導分化(第0天)，加入含有0.5 mmol/L IBMX、2.5 μmol/L地塞米松、5 μg/ml胰島素、10%胎牛血清的DMEM高糖培養液誘導48 h后；換用含5 μg/ml胰島素、10%胎牛血清的DMEM培養液誘導48 h，隨后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液繼續培養，誘導分化至第10天；90%以上的3T3-L1前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞，油紅O染色鑒定后既可用于后續試驗。

1.2.2chemerin蛋白干預分化成熟的3T3-L1脂肪細胞 將誘導分化成熟后的3T3-L1脂肪細胞，采用隨機數字表法將細胞分為 15組，予以含0.2% BSA的DMEM培養液饑餓過夜后，分別以不同濃度梯度(0、25、50、100、200 ng/ml)的chemerin蛋白作用12、24、48 h，每個濃度做3個復孔，分別收集不同濃度chemerin干預后的脂肪細胞，置-70℃冰箱凍存備用。

1.2.33T3-L1脂肪細胞總RNA提取及RT-PCR檢測visfatin、MCP-1基因mRNA的表達 按照Invitrogen公司Trizol試劑說明書提取細胞總RNA,用Gene Quant Pro紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度,確保A260/A280>1.8，1%瓊脂糖凝膠鑒定RNA的完整性。逆轉錄方法參照Promega試劑盒說明書進行操作，取總RNA 1 μg,經逆轉錄合成單鏈cDNA。根據Genebank中小鼠β-actin、visfatin和chemerin cDNA序列,應用Primer 5.0設計引物，引物序列及擴增退火溫度及擴增片段長度見表1。

表1 小鼠β-actin、visfatin、MCP-1引物信息

以6 μl逆轉錄產物cDNA為模板，進行visfatin、MCP-1及β-actin基因的PCR擴增，反應體系20 μl。MCP1與β-actin的擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環，總延伸72℃ 7 min。visfatin的擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環，總延伸72℃ 7 min。目的基因表達量的檢測：取擴增產物5 μl置于含溴化乙錠的2.0%瓊脂糖凝膠中電泳；利用Bio-Rad凝膠成像儀成像，用β-actin的吸光度值作為內參照,計算visfatin、MCP-1基因mRNA的相對表達量而進行半定量分析。

2 結 果

2.13T3-L1脂肪細胞的培養與鑒定 誘導分化前,3T3-L1前體脂肪細胞呈梭形,細胞質中不含脂滴。誘導后第2～4天細胞形態發生明顯變化,細胞體積增大,逐漸由梭形變為圓形,可見少數細胞的胞漿內開始出現亮紅的小脂滴。誘導第8～10天的細胞約90%多呈脂肪細胞表型，表現為細胞質中含多個脂滴。見圖1。

圖1 3T3-L1前脂肪細胞在誘導分化的不同時段油紅O染色結果(×200)

2.2chemerin蛋白對誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞visfatin基因表達的影響 使用不同劑量的chemerin蛋白作用于分化成熟后3T3-L1脂肪細胞，結果顯示：作用24 h后，100 ng/ml的 chemerin蛋白干預組與未干預組比較，visfatin的表達差異有統計學意義；作用48 h后；50、100、200 ng/ml的chemerin蛋白干預的細胞與未干預組比較，visfatin的表達升高(P<0.05)，且表達量隨著chemerin濃度的增加而增加，各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 不同劑量chemerin蛋白干預不同時間對visfatinmRNA表達的影響

1～5泳道:chemerin200、100、50、25、0 ng/ml；M：DNA Marker

圖2chemerin蛋白干預48hvisfatin電泳圖

2.3chemerin蛋白對誘導分化成熟的3T3-Ll脂肪細胞MCP-1基因表達的影響 使用不同劑量的chemerin蛋白作用于分化成熟后3T3-Ll脂肪細胞，結果顯示： 25、100、200 ng/ml的chemerin蛋白干預12 h后，MCP-1的表達chemerin干預組與未干預組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；作用24和48 h后，50、100、200 ng/ml的chemerin蛋白對細胞內MCP-1的表達與未干預組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3、 圖3。

1～5泳道分別表示chemerin干預劑量為200、100、50、25、0 ng/ml時，24 h后MCP-1和β-actin的擴增產物電泳圖；6～10泳道分別表示chemerin干預劑量為200、100、50、25、0 ng/ml時，48 h后MCP-1和β-actin的擴增產物電泳圖；M：DNA Marker

圖3chemerin蛋白干預24和48h后MCP-1電泳圖

表3 不同劑量chemerin蛋白對干預不同時間MCP-1基因mRNA表達的影響

3 討 論

Chemerin是Bozaoglu等〔7〕采用新的信號序列捕獲技術確定的、主要表達于成熟的脂肪細胞、并由脂肪細胞分泌的細胞因子。chemerin作為抗原呈遞細胞特異性亞群的趨化因子，在炎癥或組織損傷部位具有潛在的控制免疫應答的作用，然而其在代謝調節中的作用并不清楚。本課題組前期研究結果顯示，chemerin和visfatin表達趨勢與脂質積聚過程呈現較好的一致性，提示兩者與脂肪細胞成熟及脂質積聚有關，但是具體的作用機制目前還不清楚。

本研究表明chemerin的干預促進了visfatin的表達，并且具有明顯的時間與劑量依賴性。有研究顯示在脂肪細胞成熟階段沉默chemerin基因，將使涉及葡萄糖代謝和脂質穩態的基因表達降低；外源性給予濃度為100 ng/ml的重組人chemerin可以促進3T3-Ll前脂肪細胞在胰島素干預下的葡萄糖轉運蛋白活性增加41%。若用重組的鼠chemerin也可以得到類似的結果〔8〕。由于visfatin具有模擬胰島素的作用，因此chernerin也可能通過促進visfatin的表達來增加胰島素的敏感性。

chemerin刺激了樹突狀細胞和巨噬細胞的趨化性〔9〕，由于這些細胞表達chemerin受體，因此chemerin有可能在這些細胞向炎癥部位的募集中起作用。脂肪因子(如瘦素、TNF-α)釋放的增加以及來自脂肪細胞游離脂肪酸的增多刺激了巨噬細胞浸潤和局部炎癥應答，激活的巨噬細胞釋放附加的前炎癥分子，這些分子使炎癥應答持續發生并損傷了脂肪細胞對胰島素的敏感性〔10〕。因此，進一步研究chemerin對于炎癥反應和代謝功能的系統行為將很有意義。

MCP-1是趨化因子CC亞家族的一員，在體內由脂肪細胞、內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞等多種細胞產生，是一種單核細胞趨化和激活因子，主要趨化單核細胞和T淋巴細胞，使各種炎性細胞尤其是單核細胞向病變部位聚集。作為一種炎癥趨化因子，MCP-1可能參與肥胖的發生和發展〔11～13〕，而肥胖引起胰島素抵抗主要與脂肪組織炎性因子和炎癥信號傳導通路的激活有關。一方面，脂肪細胞數目增多和體積增大，可刺激脂肪組織分泌CRP、TNF-α和IL-6等炎性因子；另一方面脂肪組織中浸潤的巨噬細胞作為炎性細胞也分泌大量的炎性因子，抑制脂肪細胞的胰島素信號轉導，最終引起脂肪細胞廣泛溶解，釋放大量游離脂肪酸，導致胰島素抵抗。MCP-1是誘導巨噬細胞由外周血循環進入脂肪組織并使其激活的關鍵介質，同時也是一種胰島素反應因子。因此，進一步分泌的胰島素又能促進脂肪細胞等表達和分泌MCP-1，加重胰島素抵抗的進展〔14〕。chemerin蛋白可能刺激了樹突細胞和巨噬細胞的趨化性和MCP-1作為一種炎癥趨化因子在肥胖發生和發展中所起的作用，本研究表明脂肪細胞中chemerin水平的升高可能作用于MCP-1，而后者誘導巨噬細胞由外周血循環進入脂肪組織并使其激活，這可能是肥胖和胰島素抵抗等疾病發展的重要環節之一。

綜上所述，重組chemerin蛋白干預成熟的3T3-L1脂肪細胞后，使visfatin和MCP-1基因表達量上調。而在這個過程中visfatin和MCP-1基因的表達是如何被調控的，兩個基因又是如何調控脂肪細胞分化成熟的，在肥胖相關的代謝綜合征發生發展過程中是如何起作用的還均有待于進一步研究。

4 參考文獻

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