肝細胞癌中Survivin的表達與微血管密度的關系

向志鋼 楊竹林 劉云貴 周衛華

(吉首大學醫學院，湖南 吉首 416000)

腫瘤血管生成是腫瘤生長、浸潤和轉移的重要前提，研究已經證實微血管密度(MVD)與惡性腫瘤的生長、轉移和預后關系密切，已成為當前腫瘤研究的焦點和熱點〔1〕。Survivin是近年發現的一種凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的新成員，廣泛表達于多種惡性腫瘤組織中〔2〕。本文HCC組織中Survivin的表達情況及其與和MVD的相互關系。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集中南大學湘雅二醫院肝膽胰外科2008年5月至2009年5月手術切除、術后經病理診斷證實為肝細胞癌(HCC)的40例患者的癌組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)，患者年齡25～73歲(平均47.1)歲；其中男39例，女1例；術前血清甲胎蛋白(AFP)：陰性6例，陽性34例；分化程度：高、中分化23例，低分化17例；肝硬化程度：無或輕度肝硬化18例，中到重度肝硬化22例；大體形態：巨塊型35例、彌漫型和結節型5例；術中或病理證實伴肝內或/(和)肝外轉移14例；腫塊最大直徑≥ 5 cm 35例，< 5 cm 5例。所有病例術前均未進行化療和放療，癌腫均順利切除，標本經10%甲醛固定后常規石蠟包埋連續切片，切片厚4 μm。

1.2主要試劑 兔抗人Survivin多克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、生物素標記羊抗兔IgG、生物素標記羊抗鼠IgG、ABC試劑盒、DAB-HCl顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程公司。

1.3主要方法

1.3.1免疫組化 ABC免疫組化法檢測Survivin和CD34表達情況，按試劑盒說明書進行。常規切片脫蠟至水洗；3%H2O2滅活內源性過氧化物酶15 min，自來水沖洗；熱修復抗原15 min，蒸餾水洗2次；滴加適當稀釋(1∶100)的一抗，37℃孵育40 min，4℃冰箱過夜，PBS洗5 min×3次；滴加生物素標記羊抗兔(羊抗鼠)IgG，37℃孵育40 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min×3次；滴加ABC試劑，37℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次； DAB顯色，室溫下顯色20 min，自來水洗，蒸餾水洗； 蘇木素復染1 min，自來水洗15 min；脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。以0.01 mol/L、pH 7.4 的PBS液替代一抗作為陰性對照。

1.3.2結果判斷 CD34陽性結果判定：以棕黃色的內皮細胞或幼稚內皮細胞形成的、染為黃褐色的窄隙狀、囊狀和空泡狀結構即判斷為可計數的血管，參照文獻〔3〕報道的方法計數MVD；Survivin的陽性表達結果判斷：以細胞質或(和)細胞核中含黃色至棕黃色顆粒者為陽性細胞，由兩名有經驗的病理科醫師分別計數20個高倍鏡視野的陽性細胞，根據染色強度和陽性細胞率進行評分，確定陽性病例和陰性病例〔4〕。

2 結 果

2.1Survivin和CD34在HCC中的表達及MVD CD34 陽性染色位于微血管內皮細胞，癌組織中微血管形態不規整，分布不均；Survivin的陽性產物為棕黃色顆粒，位于癌細胞胞質內(圖1)。癌組織中Survivin的陽性表達率〔26(65.0%)〕和表達評分〔(2.45±1.96)分〕及MVD(66.42±11.89)均高于癌旁組織〔11(27.5%)〕、(1.35±1.64)分、(36.56±7.39)，均P<0.01。

2.2癌組織中Survivin的表達及MVD與HCC病理特征之間的關系 40例HCC癌組織中，除伴轉移病例癌組織中的MVD(72.57±11.26)顯著高于無轉移病例(64.25±12.11)(P<0.05)外；Survivin的表達及MVD與HCC其他臨床病理特征之間未見任何關系，見表1。

2.3HCC癌組織中Survivin的表達與MVD的關系 等級相關分析顯示，HCC癌組織中Survivin的表達評分與MVD呈正相關(r=0.327，P=0.039)。

表1 癌組織中Survivin的表達及MVD與HCC臨床病理特征之間的關系±s)

圖1 CD34及Survivin在HCC中的陽性表達(ABC，×200)

3 討 論

Survivin是Altiler等在1997年用效應細胞蛋白酶受體-1(EPR-1) cDNA在人類基因組庫中篩選并分離得到的蛋白，是IAP家族中的重要成員，主要表達于胚胎和發育的胎兒組織，不見于成人終末分化的組織(胸腺除外)，主要參與調解細胞的增殖和凋亡，被認為是迄今發現的最強的凋亡抑制因子〔5，6〕。研究表明，Survivin在大多數惡性腫瘤中都有表達，在腫瘤的發生發展、浸潤、轉移和腫瘤的血管生成調節中發揮著重要的作用，是腫瘤預后的獨立判斷指標，并有望成為惡性腫瘤治療的新靶點〔2，7〕。本研究說明Survivin與HCC的發生、發展可能有著密切的關系。本研究沒有發現Survivin的表達情況與HCC主要臨床病理特征之間的關系，說明Survivin在HCC的發生、發展中的具體作用機制仍有待于進一步研究證實。

腫瘤的生長、浸潤和轉移均有賴于血管的生成， MVD是目前采用最多的檢測腫瘤血管生成的指標，是惡性腫瘤預后的獨立判斷指標〔1〕。本資料提示MVD高的HCC侵襲力強，容易擴散和轉移。血管生成是多個復雜過程共同作用完成，其中血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管形成素-1(Ang-1)等起著關鍵的作用。研究表明，在用VEGF、bFGF、Ang-1等誘導靜止期的內皮細胞分裂時發現這些血管形成因子的作用依賴于Survivin的表達上調〔8,9〕；聯合應用反義寡核苷酸技術和RNA干擾技術可降低內皮細胞中Survivin的表達，可完全消除VEGF對腫瘤壞死因子或神經酰胺誘導的細胞凋亡的抵抗作用，引起凋亡增加和干擾血管生成〔10〕。本組資料提示Survivin參與了HCC的新生血管生成，在HCC的正性調控中可能起著重要的作用。

綜上，Survivin在HCC的發生發展中有著重要作用，并與HCC的血管生成關系密切，其具體機制有待進一步研究。

4 參考文獻

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