芬太尼與5-氟尿嘧啶聯合應用對MCF-7乳腺癌細胞增殖與細胞周期的影響

王志學 雷 燕 王利軍 張曉俠 李汝泓

(承德醫學院附屬醫院麻醉科，河北 承德 067000)

阿片類藥物作為乳腺癌癌痛治療的主要手段之一，往往是與化療同時進行，因此阿片類藥物對化療藥抗腫瘤作用的影響值得關注。筆者前期研究證實〔1，2〕，一定濃度的嗎啡、5-氟尿嘧啶(5-FU)及聯合應用對人乳腺癌細胞(MCF-7)增殖抑制作用，兩藥聯合應用48、72 h，既抑制了G0/G1期到S期的轉化，又抑制了S期向G2/M期的轉化，可顯示出協同作用。并且對增殖抑制與細胞周期的影響與其中嗎啡的濃度有一定的劑量依賴關系。近年來隨著新技術、新劑型的出現，芬太尼正越來越多地應用于癌痛治療中。以往有報道顯示〔3～5〕，同為阿片類藥物的芬太尼，也有抑制MCF-7生長的作用，并能劑量依賴性地誘導MCF-7凋亡，顯著減少腫瘤細胞所致的組織破壞。在與5-FU聯合應用對MCF-7增殖影響方面，芬太尼是否也有嗎啡類似的效應尚有待闡明，本研究將做相關探討。

1 材料和方法

1.1材料 主要試劑和儀器：二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI)，美國Sigma公司；RPMI1640培養基，GIBCOBRL公司；胎牛血清,天津血液學研究所；胰蛋白酶，中國醫學科學院血研所科技公司。YT-CJ-1N超凈工作臺，北京亞泰科隆實驗科技開發中心；FACSCalibur流式細胞儀，美國B&D公司； CO2電熱恒溫培養箱，日本SANYO公司；LD5-IA低速離心機，北京雷勃爾離心機有限公司； QL-901振蕩器，中國其林貝爾；熒光倒置顯微鏡，日本尼康；光學顯微鏡、倒置顯微鏡，日本OLYMPUS。 芬太尼注射液，宜昌人福藥業；5-FU注射液，上海旭東海普藥業。MCF-7南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 細胞復蘇成功后，調整濃度為1×106/ml接種于培養瓶，靜置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養箱內，用RPMI1640完全培養液進行培養，隔日換液。觀察待貼壁70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2實驗分組 共分為8組，分別用含不同藥物的RPMI1640完全培養液培養：U組(未處理組)即對照組，LF組為0.1 μmol/L芬太尼處理組，MF組為1 μmol/L芬太尼處理組，HF組為10 μmol/L芬太尼處理組，FU組為500 μmol/L 5-FU處理組，LF+FU組為0.1 μmol/L芬太尼與500 μmol/L 5-FU聯合處理組，MF+FU組為1 μmol/L芬太尼與500 μmol/L 5-FU聯合處理組，HF+FU組為10 μmol/L芬太尼與500 μmol/L 5-FU聯合處理組。

1.2.3MTT法測定MCF-7的增殖活性 取對數生長期的細胞，消化，調整密度至4×104/ml，接種于3塊96孔培養板，每板分8組，每組種10個復孔，100 μl/孔。常規培養24 h后，更換為含不同藥物的培養液(詳見1.2.2)200 μl，三塊板分別各孵育24、48、72 h。屆時吸棄原培養液，每孔內加入180 μl無血清RPMI1640、20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，分別混勻，繼續培養4 h。再加入150 μl DMSO/孔，振蕩10 min(120 r/min)后，在酶標儀下測定波長490 nm處的OD值。按以下公式計算對MCF-7的增殖抑制率(IR)：IR=(1-處理組OD值/對照組OD均值)×100%。

1.2.4流式細胞術(FCM)檢測對細胞周期影響 取對數生長期的細胞，調整細胞濃度約5×105/ml，傳至25 ml細胞培養瓶，共64瓶。常規培養24 h后，根據分組不同更換為含不同藥物的培養液5 ml，每組8瓶，分別各孵育48 h。屆時吸棄上清，消化、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，收集細胞(約106/ml以上)于離心管；每管加75%酒精4 ml，4℃固定24 h；4℃低速離心(1 500 r/min、5 min)，徹底去除酒精；PBS洗滌，震蕩，PI染色，室溫避光放置30 min，流式細胞儀上機檢測。用Modfit LT軟件分析各個細胞周期內細胞數的百分比，并按以下公式計算增殖指數(PI)：PI=(S+G2M)/(G0/G1+ S+G2M)×100%。

2 結 果

2.1MTT法檢測各處理組對MCF-7增殖活性的抑制情況 顯微鏡下觀察MCF-7藍紫色結晶情況：可見在加DMSO前，未處理組結晶最多，每個時間點其他各處理組較未處理組均有不同程度減少。各不同濃度的芬太尼與5-FU聯合應用在處理48、72 h時，結晶比單獨用5-FU或單獨應用該濃度的芬太尼明顯減少。芬太尼單獨應用時，與未處理組相比，均引起IR增加(P<0.05)；5-FU單獨應用時，IR亦均增加(P<0.05)。芬太尼與5-FU聯合應用，增殖抑制作用均強于各藥單獨應用(P<0.05)；作用24 h時，三種濃度的芬太尼與5-FU均無協同作用(P>0.05)，作用48、72 h時，均具有協同作用(P<0.05)。IR隨著其中芬太尼濃度增加依次增加。見表1。

2.2芬太尼、5-FU及聯合應用對細胞周期的影響 單獨應用芬太尼處理時，G0/G1期細胞比例隨著芬太尼濃度的增加依次增加(P<0.05)，S期細胞比例隨著芬太尼濃度的增加依次降低(P<0.05)，PI亦依次降低，而G2/M期細胞比例無明顯變化(P>0.05)。單獨應用500 μmol/L 5-FU處理時，G0/G1期、S期細胞比例均增加(P<0.05)， G2/M期細胞比例減少(P<0.05)，PI亦降低的芬太尼單獨處理組均減少(P<0.05)；PI亦隨其中芬太尼濃度增加依次降低；三種濃度芬太尼與5-FU聯合應用，在G2/M期細胞比例和PI減少方面均具有協同作用(P<0.05)。見表2。

表1 各組MCF-7乳腺癌細胞在不同時間點的增殖抑制率±s,n=10)

表2 不同藥物處理48 h后對MCF-7細胞周期的影響±s，n=8，%)

3 討 論

芬太尼作為最常用的μ阿片受體激動劑之一，屬于強效麻醉性鎮痛藥，其鎮痛強度約是嗎啡的100倍，鎮痛作用產生快，因此常用于圍術期鎮痛、鎮靜、癌痛等各種原因引起的疼痛。乳腺癌的癌痛治療亦不例外，因其往往與化療同時實施，芬太尼也在抵御化療帶來的巨大不適方面發揮積極作用，并且對化療藥的抗腫瘤效應帶來一定影響〔6，7〕。本實驗通過體外培養的MCF-7，旨在排除在體內的應激、免疫等因素的影響，在細胞水平上探究芬太尼對5-FU為代表的化療藥抗腫瘤作用的直接影響〔8〕。

細胞增殖抑制及細胞凋亡與細胞周期受阻密切相關。一個親代細胞依次經歷分裂間期和分裂期后，形成兩個遺傳物質完全相同的子代細胞,完成其增殖過程〔9〕。本實驗中單獨應用不同濃度芬太尼處理，發現芬太尼濃度從0.1 μmol/L開始直至10 μmol/L，作用24、48、72 h時均具有明顯的增殖抑制作用，并且隨著作用濃度和作用時間的增加，芬太尼細胞增殖抑制作用越明顯，呈現不同程度的劑量-時間依賴關系。此結果與張咸偉等〔3〕的觀點基本一致。細胞增殖抑制及細胞凋亡與細胞周期受阻密切相關。G1期是細胞質復制的主要階段，也易接受外界因子的影響。G1期末有一個稱為限制點特定時期，在細胞外條件適宜的情況下，細胞一旦通過限制點，即便撤去刺激生長和分裂的外界信號，仍能沿著細胞周期向前運轉，成為一個自主過程直至完成細胞分裂。而在不適于分裂增殖的細胞外條件下，細胞會延長停留在G1期，甚至暫時退出細胞周期，進入G0期。細胞周期的流式細胞儀分析表明，芬太尼也可能如嗎啡一樣，是通過時間-劑量依賴地誘導MCF-7主要被阻滯于G0/G1期，引起細胞DNA合成減少，從而達到增殖抑制〔10〕。阻滯在G0/G1期的細胞一旦進入細胞周期，則可引起周期基因不適當的活化，不是導致增殖，反而誘導凋亡〔11〕。

單獨應用50 μmol/L 5-FU作用24、48、72 h均明顯的有增殖抑制，細胞周期數據顯示5-FU更主要的是通過阻滯細胞周期于S期(G0/G1期也有部分阻滯)從而引起增殖抑制。并且，由于細胞周期被抑制，使處于分裂期的細胞(G2/M)比例顯著減少。

更重要的是本研究首次將兩藥聯合應用作用于MCF-7。MTT結果中發現，由于作用24 h時聯合用藥后效果未充分顯現，而到作用72 h時增殖抑制過強，尤其兩藥聯合使用時導致細胞存活率過低，故只選擇作用48 h時進一步進行后續的細胞周期分析的實驗研究。細胞增殖是生物體生長、發育、繁殖的基礎。當增殖信號作用于細胞膜或胞漿受體時，通過細胞內信號傳遞進而影響細胞周期的循環〔9〕。兩藥聯合使用后，發現既抑制了G1期到S期的轉化，又抑制了S期向G2/M期的轉化，這種協同作用與芬太尼造成G0/G1期阻滯和5-FU致S期阻滯有關，使處于G2/M的細胞比例顯著減少，從而可能使DNA合成減少并明顯抑制細胞的增殖。并且這種細胞周期阻滯存在劑量依賴性，這種結果當然是兩藥分別影響細胞周期聯合作用的體現，也正與PI的變化相吻合。雖然臨床上目前尚未證實阿片類藥物對化療病人的轉歸有何影響，但是上述分析中發現芬太尼亦與前期研究的嗎啡相仿，應用的益處并不僅限于鎮痛，其可通過調節細胞周期協同對細胞增殖抑制，從而提高5-FU的抗乳腺癌作用。但基于體外培養離體細胞尚不能完全反映體內復雜的內環境，因此仍有較大差異，確切臨床效果還有待于進一步證實。

4 參考文獻

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2王志學,孫立新,李汝泓,等.不同濃度的嗎啡與5-氟尿嘧啶聯合應用MCF-7乳腺癌細胞凋亡與細胞周期的影響〔J〕.中國老年學雜志,2012；32(15):3223-6.

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