核因子-κB/p65和環氧化酶-2表達對非小細胞肺癌患者預后的影響

姜 偉

(齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院呼吸內科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

由于環境污染、吸煙等因素影響，肺癌是我國目前最主要的惡性腫瘤之一。在所有肺癌中非小細胞肺癌(NSCLC)占75%～85%〔1〕，該類型肺癌治療不佳，5年存活率約為14%，隨著細胞遺傳學和分子生物學的發展，對于原癌基因和抑癌基因的探究和分析使得NSCLC的診斷和治療進入了新的突破點，采用新的生物治療方法有可能使肺癌獲得更好的療效〔2〕。體內外試驗都發現在上皮腫瘤(如肺癌)中核因子(NF)-κB/p65高表達，NF-κB能調節抗凋亡基因的轉錄來抑制化療誘導的凋亡，在乳腺癌患者p65的活化能夠抵抗新的輔助化療。此外，NSCLC中最為常見的是環氧化酶(COX)-2過表達。COX-2是一種誘導酶，能被細胞因子、生長因子、癌基因和化學致癌物所激活〔3〕，本研究觀察NSCLC患者NF-κB/p65和COX-2的表達水平及其與臨床病理類型的關系和預后作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 2011年1月至2011年12月我院呼吸內科NSCLC患者50例，納入標準為： ①治療過程中有完整的病例及隨訪資料包括常規實驗室檢驗：血常規，肝、腎功能，生化檢驗，肺活量檢測，胸部CT，神經系統檢查以及體重變化情況，②體能狀態評分(ECOG)≤2，血液學參數正常。③纖維支氣管活檢檢查，并從相同病例體內支氣管黏膜采集20例正常組織作為對照。排除標準：有其他部位惡性腫瘤，有嚴重臟器功能不全或者凝血功能障礙的患者，近期有嚴重感染性疾病，之前進行過化放療或者手術的患者。均知情同意，并經過我院的倫理委員會同意。根據國際評級體系確定臨床和病理學分級〔4〕。

1.2纖維支氣管鏡檢查 術晨空腹，檢查前30 min肌肉注射0.6 mg硫酸阿托品。使用10%利多卡因噴霧對上呼吸道進行局部麻醉后支氣管鏡從鼻腔進入；使用2%的利多卡因對聲帶、氣管和下呼吸道進行麻醉。對可見的腫瘤進行組織活檢，并從支氣管樹的其他位置采集多點呼吸道內膜組織樣本作為對照。觀察采集樣本，排除所有發育不良的組織，仔細將樣本分離并利用10%甲醛溶液固定。

1.3組織病理學試驗和隨訪 使用蘇木精/伊紅染色進行常規的組織病理學特征的評估并對腫瘤進行評級〔4〕。然后進行免疫組化試驗：將組織蠟塊切成3 μm的切片，在二甲苯中脫蠟30 min，在梯度酒精中水化。然后將組織切片浸入10 mm pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液(LabVisioncatalog#AP-9003)中，煮沸10 min，對切片進行抗原修復，室溫冷卻20 min，再磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗1 min。將切片在3%的過氧化氫浸泡10 min阻斷內源過氧化物酶，然后在PBS中沖洗。使用Ultra Vision Detection Kit(TP-015-HD,Lab Vision, USA)進行免疫組化染色。使用Ultra V封閉10 min以減少非特異性背景，用PBS漂洗。接著在濕盒中孵育一抗〔兔單抗，抗COX-2(CloneSP21,Cat.No.RM-9121-R7,Readytouse,LabVision)和兔多抗，抗NFkB/p65(RelA) Ab-1(Cat.No.RB-1638-R7,Readytouse,LabVision)〕過夜，12 h后用PBS漂洗，用4～5滴UltraVision生物素耦聯的羊多價作為二抗覆蓋切片，室溫孵育10 min，再次用PBS沖洗，使用鏈霉親和素過氧化物酶溶液在室溫孵育10 min，PBS沖洗。滴加1滴DAB孵育15 min。最后用Mayer蘇木素復染，在酒精中脫水，然后加DPX。用已知的COX-2過表達的結腸癌患者的組織切片和NF-κB/p65過表達的前列腺癌患者的組織切片作為陽性對照，使用未加一抗的樣品作為陰性對照。支氣管鏡檢查明確病理診斷后，根據臨床醫生的建議，對患者進行手術或者放化療，隨訪4～22(平均13)個月。

1.4免疫組化評估和評分 根據胞質免疫組化染色差異反應的細胞比例對COX-2表達水平進行半定量分析。免疫染色樣本評分標準如下：無反應(0)，弱(+)，中()，強()。腫瘤細胞NF-κB表達陽性是指呈現NF-κB核表達差異(NF-κB活化)。根據NF-κB的核定位進行陽性和陰性細胞的分類，在100倍顯微鏡觀察核染色陽性細胞比例，分為<1%，1～10%，和>10%(陽性)。每個樣本至少計數5個不同的區域取均值。

1.5統計學分析 使用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗和log-Rank分析。

2 結 果

2.1一般情況 20例早期病例(Ⅰ,Ⅱ,ⅢA期)中只有3例接受肺葉切除手術，其余無法手術或者拒絕手術。9例接受胸部放療，17例同時進行了卡鉑/紫杉醇的化療以及胸部放療。剩余的晚期和有轉移病例(Ⅳ期)只接受含鉑藥物的化療，同時轉移部位局部接受放療。

2.2NF-κB/p65的免疫組化分析 見表1和圖1。腫瘤的惡性程度高、分期晚(Ⅲ和Ⅳ期)和淋巴結轉移的NSCLC患者NF-κB/p65表達明顯升高。鱗狀細胞癌和腺癌患者NF-κB/p65的表達水平高于正常肺組織(P<0.01)；腺癌患者NF-κB/p65的表達水平高于鱗狀細胞癌和大細胞癌患者(P<0.01)。NF-κB的表達水平與患者的年齡、性別、吸煙史、組織病理學類型、腫瘤級別、腫瘤分期和身體狀況顯著相關(P<0.05)。NF-κB/p65表達水平在1%，1%～10%和>10%的病例的平均生存時間分別為17.27，16和7個月；NF-κB陰性病例的平均生存時間為20.77個月，陰性患者生存時間明顯延長(P<0.05)。

表1 NF-κB、COX-2表達水平與患者臨床病理學特征之間的關系〔n(%)〕

支氣管腺癌>10%的腫瘤細胞中NF-κB/p65核表達

支氣管鱗狀細胞癌>10%的腫瘤細胞中NF-κB/p65

支氣管大細胞癌1%～10%的腫瘤細胞中NF-κB/p65核表達

2.3COX-2表達的免疫組化分析 腫瘤惡性程度高，分期晚(Ⅲ和Ⅳ期)和淋巴結轉移的患者COX-2表達水平越高。所有腺癌病例(100%)COX-2表達陽性，顯著高于鱗狀細胞癌和大細胞癌(P<0.01)。COX-2的表達水平與患者的性別、組織病理學類型、腫瘤等級、腫瘤分期、淋巴結轉移和身體狀況有關(P<0.05)。COX-2表達水平為(+),()和()的病例的存活平均時間分別為15.09，15.86和11個月，而COX-2表達陰性的患者存活時間為25.67個月，陰性患者生存時間明顯延長(P<0.05)。見表1和圖2。NSCLC患者免疫組化結果顯示COX-2和NF-κB/P65的表達呈明顯的正相關(χ2=58.682,P<0.001)。

支氣管腺癌

支氣管鱗狀細胞癌

支氣管大細胞癌

3 討 論

NF-κB的常見形式為由p65 和p50組成的異源二聚體〔5〕。在多數正常細胞中，NF-κB與其抑制物結合，其核定位序列被隱藏，定位于胞質中。NF-κB調節多種在腫瘤發生中起重要作用的分子，如基質金屬蛋白酶，COX-2，iNOS，趨化因子和炎癥細胞因子等〔6〕，這些分子都能夠促進腫瘤細胞的侵襲和新生血管生成。NF-κB的p65亞基是一種參與細胞存活，周期分布和凋亡調控的基因〔7〕。Tang等〔8〕發現p65的表達對具有對抗塞來昔布介導的乳腺癌細胞凋亡的細胞保護作用，說明NF-κB與細胞增殖調控和腫瘤形成之間存在密切的關系，參與腫瘤的發生發展，而且腫瘤細胞通過NF-κB獲得對抗癌藥物和放療的耐受性，因此抑制NF-κB的活化能改善抗癌藥物的療效〔9〕。Tang等〔8〕發現在多數(54%)NSCLC患者核表達水平高，與本研究結果一致，NF-κB/p65可以作為肺癌患者對于化療和放療應答情況的預測指標。本試驗說明NF-κB/p65與腫瘤的惡性程度呈正比，是影響患者生存時間的反向指標。Fidler 等〔10〕發現肺部腺癌患者中NF-κB/p65的表達水平在晚期腫瘤(Ⅲ和Ⅳ期)患者中更高，特別是在全身和淋巴結轉移腫瘤中更高。

腫瘤可以誘導COX-2活化，并激活下游相關酶類(如PGE2)，這種作用能增強腫瘤的侵襲和轉移，血管生成，降低宿主免疫功能，抵抗凋亡〔11〕。本試驗發現在NSCLC患者中COX-2表達增加，特別是在腺癌中尤為明顯，這與之前的許多報道〔9〕一致。而且腺癌中COX-2的表達水平高于鱗狀細胞癌和大細胞癌,這說明腫瘤相關的COX-2表達上調也是侵襲型NSCLC發生發展的獨特標志。研究發現COX-2的致癌作用主要是通過提高前列腺素(如PGE2)水平來實現的〔12〕。COX-2的抑制劑已經進入前臨床和臨床試驗階段，其能與放療和化療藥起到協同作用。非甾體抗炎藥能提高放療和化療的細胞毒性〔13〕。在臨床試驗中，NSCLC患者在術前使用塞來昔布(一種選擇性COX-2抑制劑)能提高紫杉醇和卡鉑的應答率。比如在Yoon等〔14〕進行的試驗中，將塞來昔布(COX-2的抑制劑)和化療藥物聯合使用比單純使用化療藥物治療晚期NSCLC(COX-2水平提高)的存活率更高。Lin等〔15〕也指出在COX-2過表達的肺癌患者使用塞來昔布治療獲得的存活率比沒有COX-2過表達患者的存活率要高。對于預后差的患者，COX-2表達可以作為一個治療靶點，選擇性COX-2抑制劑可能抑制腫瘤血管生成和轉移并用于長效維持治療中。

吸煙可能會誘導NF-κB調控的COX-2的表達，而塞來昔布能抑制這種誘導作用，這就證實了吸煙與肺癌發生之間存在著特定的機制。Zhan等〔16〕通過免疫組化指出NSCLC患者NF-κB的表達水平是整體存活率的獨立預測因素，這與本試驗結論是一致?；罨腘F-κB直接發揮COX-2轉錄因子的作用。NSCLC患者NF-κB/p65和COX-2的表達水平具有預后意義，并且二者可以作為發展新的肺癌治療方法的靶點，抑制NF-κB和COX-2能增強抗癌治療的療效。

4 參考文獻

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15Lin BQ, Zeng ZY, Yang SS,etal.Dietary restriction suppresses tumor growth, reduces angiogenesis, and improves tumor microenvironment in human non-small-cell lung cancer xenografts〔J〕.Lung Cancer,2013;79(2):111-7.

16Zhan P, Qian Q, Yu LK.Prognostic value of COX-2 expression in patients with non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis〔J〕.J Thorac Dis,2013;5(1):40-7.