SLP-2基因在直腸癌中的表達及意義

張 劍 吳 敏 張自森 王利娟 張紅巧 師廣勇 巴 楠 閆 琳 鄭曉珂 邢 鑫

(鄭州大學第五附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，是大腸癌的最常見部分，我國直腸癌的發病率和死亡率均明顯升高。SLP-2基因屬于stomatin基因家族成員，是2001年發現的一個新基因〔1〕，近年來的研究顯示，SLP-2在多種惡性腫瘤中過表達，可能是一個新的腫瘤相關基因〔2～6〕。本研究擬分析SLP-2蛋白的表達水平及與臨床病理資料的關系，旨在探討SLP-2在直腸癌中的表達特點及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1臨床資料 直腸癌組織及距離癌組織邊緣>5 cm的癌旁正常直腸組織為鄭州大學第五附屬醫院2010年1月至2011年1月手術切除直腸癌標本40例，其中男21例，女19例，年齡48～76歲，中位年齡63歲。所有標本均經病理學檢查確診為直腸癌，術前未接受過放、化療。臨床分期按TNM分期標準(AJCC 2010年第7版)。

1.2RT-PCR SLP-2擴增片段長度500 bp，正義5′-CTGGAGCCTGGTTTGAACAT-3′；反義5′-AGGATCTGGGCCTGTTTCTT-3′。內參β-actin擴增片段長度242 bp，正義5′- ACACTGTGCCCATCTACGACC-3′；反義5′-AGGGGCCGGACTCGTCATAGA-3′。引物由上海生工公司合成。PCR反應體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，SLP-2及內參上、下游引物各 1 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補至25 μl。PCR反應：預變性：94℃，5 min，變性94℃，30 s，退火55℃，30 s，延伸72℃，50 s，30個循環，延伸72℃，7 min。擴增產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶圖像凝膠成像儀掃描，以SLP-2與β-actin的灰度值的比值表示SLP-2 mRNA的相對表達水平。

1.3免疫組化 鼠抗人SLP-2單克隆抗體稀釋度為1∶200，購自美國proteintech公司。免疫組化試劑盒購自邁新公司。用已知陽性片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。操作步驟按試劑盒說明書進行。結果判定標準參照文獻〔7〕，由兩位高年資病理醫師在雙盲條件下進行評分，每張切片根據陽性細胞百分數及陽性細胞染色程度進行評分。細胞膜及細胞質染色程度評分由每張切片的大多數細胞染色情況決定，0分：無著色，1分：淺黃色，2分：黃色，3分：棕黃色。陽性細胞百分數評分：0分：沒有陽性細胞，1分：1%～25%陽性，2分：26%～50%陽性，3分：51%～75%陽性，4分：>75%陽性。兩者分數相乘為總分，≥8分為高表達，<8分為陰性或低表達。

1.4統計學分析 應用SPSS16.0軟件行χ2或t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1SLP-2 mRNA在直腸癌及癌旁正常直腸黏膜中的表達 正常直腸組織SLP-2 mRNA表達水平為0.66±0.12，直腸癌組織SLP-2 mRNA表達水平為1.35±0.27，二者比較差異有統計學意義(F=7.076，P=0.019)，見圖1。

圖1 直腸癌(C)及癌旁正常組織(N)中SLP-2 mRNA的表達

2.2SLP-2蛋白在直腸癌及癌旁正常直腸黏膜中的表達 SLP-2在直腸癌組織中多呈高表達，在癌旁正常直腸黏膜中多為陰性或低表達。SLP-2在直腸癌和癌旁正常直腸黏膜中的高表達率分別為67.5%(27/40)和22.5%(9/40)，差異有統計學意義(χ2= 16.364，P=0.000)，見圖2。

2.3SLP-2蛋白表達與直腸癌臨床病理特征之間的關系 見表1。

表1 SLP-2的表達與直腸癌臨床病理參數的關系(n)

3 討 論

SLP-2基因是2000年首次發現并命名的一個新基因，近年來的研究顯示，SLP-2在多種惡性腫瘤中呈高表達，可能是一個新的惡性腫瘤相關基因。但目前有關SLP-2在直腸癌中的表達情況及對直腸癌影響的研究較少。本研究采用免疫組化法及RT-PCR法發現SLP-2在直腸癌組織中表達升高，并通過分析直腸癌患者的臨床病理資料，發現在較晚期、有淋巴結轉移的病例中SLP-2表達升高更為明顯。提示SLP-2可能是一個與直腸癌分期和轉移相關的指標，在直腸癌的發展和轉移中起一定的促進作用。

SLP-2是一種細胞質膜相關蛋白，與細胞脂閥結構密切相關，并存在于細胞線粒體中，參與調解線粒體的能量代謝〔1，7～10〕。由于脂筏內有多種細胞信號傳導分子，可參與許多細胞信號傳導通路，而線粒體的能量代謝可直接影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等特性，因此推測，SLP-2可能通過調節細胞信號傳導通路及細胞能量代謝參與腫瘤的發生發展。Horiuchi等〔11〕的研究發現，SLP-2可能通過與Rho家族蛋白的相互作用，調節細胞信號傳導通路，參與卵巢癌的侵襲轉移。祁代華等〔12〕的實驗顯示，結直腸癌組織中SLP-2與Rho家族的CDC42蛋白表達呈正相關。Cao等〔13〕的研究發現，SLP-2可能通過激活MAPK / ERK信號通路促進食管癌的侵襲和轉移。Wang等〔7〕的研究報道，SLP-2可能通過調節細胞線粒體膜電勢和ATP水平，影響食管癌的運動及增殖。Hájek等〔9〕報道，轉染SLP-2 siRNA下調Hela細胞的SLP-2表達后，Hela細胞線粒體膜電勢降低。目前SLP-2在惡性腫瘤中的作用機制尚未完全闡明，有待進一步深入探索。

本研究發現SLP-2在直腸癌組織中呈高表達，并與直腸癌的淋巴結轉移和TNM分期相關。惡性腫瘤的分期及是否有淋巴結轉移和遠處轉移是決定其預后的重要因素，因此，SLP-2可能作為直腸癌的一個有意義的預后指標，指導直腸癌患者的預后生存，并有可能作為一個新的腫瘤靶向治療的靶點。

4 參考文獻

1Wang Y，Morrow JS.Identification and characterization of human SLP-2，a novelhomo- logue of stomatin ( band 7.2b ) present inerythrocytes and other tissues〔J〕.J Biol Chem，2000；275(117)：8062-71.

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7Wang YQ，Cao WF，Yu ZC，etal.Downregulation of a mitochondria associated protein SLP-2 inhibits tumor cell motility，proliferation and enhances cell sensitivity to Chemo- therapeutic reagents〔J〕.Cancer Biol Ther，2009;17(151)：1651-8.

8Sprenger RR，Speijer D，Back JW，etal.Comparative proteomics of human endothelial cell caveolae and rafts using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry〔J〕.Electrophoresis，2004;25(1)：156-72.

9Hjek P，Chomyn A，Attardi G.Identification of a novel mitochondrial complex containing mitofusin 2 and stomatin-like protein 2〔J〕.J Biol Chem，2007;282(8)：5670- 81.

10Christie DA，Lemke CD，Elias IM，etal.Stomatin-like protein 2 binds cardiolipin and regulates mitochondrial biogenesis and function〔J〕.Mol Cell Biol,2011;31(18)：3845-56.

11Horiuchi A，Imai T，Wang C，etal.Up-regulation of small GTPases，RhoA and RhoC，is associated with tumor progression in ovarian carcinoma〔J〕.Lab Invest，2003;83(7)：861-70.

12祁代華，李建生，王康康.SLP-2和CDC42蛋白在結直腸癌組織中的表達及臨床意義〔J〕.中華消化雜志，2009;29(2)：191-2.

13Cao W，Zhang B，Ding F，etal.Expression of SLP-2 was associated with invasion of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.PLoS One,2013;8(5)：e63890.